急性髓系白血病患者巨噬细胞移动抑制因子表达水平及其与疗效、预后相关性分析

马 兵，张丽红，赵 丹，尹婉宜，沈 扬，董 雯，刘清池

(河北医科大学第一医院血液内科，河北 石家庄 050031)

急性髓系白血病(Acute myeloid teukemia，AML)是一种因髓系造血干细胞改变并导致原始和幼稚髓细胞比例异常变化的恶性肿瘤[1]。流行病学研究[2]显示，AML发病复杂，与环境、遗传、化学物质接触等均有关，占成年急性白血病的80%～90%，且男性发病率更高。目前，临床治疗AML仍以化疗及造血干细胞移植为主，但治疗后完全缓解(Complete remission，CR)仅为50%～70%，预后较差[3]。另外，大约50%的AML患者染色体检查正常，但预后却存在较大差异，5年内生存率为24%～42%[4]。基于此背景，从分子遗传学角度探究AML发病机制，对患者治疗方案的调整及预后改善均具有重要意义。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor，MIF)属于免疫调节因子的一种，可广泛参与人体炎症释放、氧化应激、肿瘤形成等病理过程[5]。现临床上针对MIF与冠心病、肾癌、慢性阻塞性肺疾病等疾病的关系已有报道[6-8]，但其与AML患者预后的相关性研究尚无确切定论。因此，本研究探讨AML患者MIF表达水平与预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2015年9月至2019年9月收治的急性髓系白血病(AML)初诊患者132例，其中男性81例，女性51例；年龄31～57岁，平均(42.15±5.46)岁；美国西南肿瘤协作组(SWOG)分型中，良好42例，中危52例，高危38例；美国和英国协作组(FAB)诊断标准分型中，M1型12例，M2型58例，M4型40例，M5型22例；骨髓幼稚细胞比例<60%者56例。病例纳入标准：①符合《成人急性髓系白血病(非急性早幼粒细胞白血病)中国诊疗指南(2017年版)》[9]中AML诊断标准，并经骨髓细胞学、免疫分型、遗传学等检查确诊；②自愿签署知情同意书；③临床各项检查资料完整；④年龄≥18岁；⑤初次确诊为白血病，并于我院接受柔红霉素联合阿糖胞苷化疗诱导及中大剂量阿糖胞苷巩固治疗；⑥染色体核型正常。排除标准：①合并严重器官功能衰竭、全身免疫系统疾病、精神类疾病等；②合并其他恶性肿瘤；③合并活动性肺结核或其他器官感染；④哺乳及妊娠期妇女。本研究已通过本院医学伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 骨髓液及外周血标本采集：入组患者均于化疗前无菌采集骨髓液3 ml，置于乙二胺四乙酸抗凝管中，淋巴细胞分离液密度梯度分离单核细胞，然后以1500 r/min离心5 min，弃上清，-80 ℃保存待测。入院次日清晨采集空腹肘静脉血5 ml，加入抗凝剂，以3000 r/min离心15 min，留上清，-80 ℃保存待测。

1.2.2 MIF表达水平检测：取适量骨髓液及外周血标本，加入1 ml总RNA提取试剂TRIzol，混匀后静置5 min。加入200 μl氯仿，再次震荡后混匀并静置5 min。室温下12000 r/min离心15 min，取上层加入等量异丙醇溶液，震荡混匀后静置10 min，12000 r/min离心15 min，弃上层液体，加入75%乙醇溶液多次洗涤。待干后加入焦碳酸二乙酯(DEPC)溶液溶解。采用美谱达UV-1800PC紫外可见分光光度计测定总RNA浓度及纯度，以OD260/OD280在1.8～2.0为合格标准。于美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库中检索MIF序列引物，吸取2 μg总RNA，加入Oligo(dT)再生溶液1 μl、Reaction Mix Easy溶液10 μl、Trans Script两步法RT-PCR试剂1 μl，并加入去RNA酶水至20 μl，构成总反应体系。PCR参数为：95 ℃ 5 min，95 ℃ 50 s，60 ℃ 50 s，72 ℃ 60 s，共30个循环，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(GAPDH)作为内参。基因引物序列见表1。

表1 基因引物序列

1.2.3 疗效判定标准：参考《血液病诊断及疗效标准》第3版[10]，贫血、发热、出血等相关症状体征基本消失，男性患者血红蛋白(Hb)水平≥100 g/L，女性患者Hb水平≥90 g/L，血小板(PLT)水平≥100×109/L，中性粒细胞绝对值(ANC)≥1.5×109/L，外周血标本检测无白血病细胞，骨髓原始细胞比例≤5%，判定为CR；贫血、发热、出血等相关症状体征有所改善，生化指标检测中有1项及以上未达CR标准，5%<骨髓原始细胞比例≤20%，判定为部分缓解(PR)；临床症状体征及生化指标均未达到以上标准，骨髓原始细胞比例>20%，判定为未缓解(NR)。有效=CR+PR，无效=NR。

1.3 观察指标 比较不同临床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表达水平，临床特征包括年龄、性别、抗原类型[人类白细胞DR抗原(HLA-DR)、白细胞分化抗原(CD)34、CD33、髓过氧化物酶(MPO)、CD13]、骨髓原始细胞数；比较不同疗效患者MIF表达水平；比较不同MIF表达水平患者无病生存期(DFS)；分析AML患者MIF表达水平与疗效及预后的相关性。

2 结 果

2.1 不同临床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表达水平比较 见表2。不同性别及抗原类型的AML患者骨髓液和外周血中MIF表达水平比较，差异无统计学意义(均P>0.05)。≥45岁AML患者骨髓液及外周血中MIF表达水平均明显高于<45岁患者，骨髓原始细胞数≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表达水平均明显高于骨髓原始细胞数<60%的患者(均P<0.05)。

表2 不同临床特征AML患者骨髓液和外周血中MIF表达水平比较(ng/ml)

2.2 不同疗效AML患者骨髓液和外周血中MIF表达水平比较 见表3。治疗有效患者骨髓液及外周血中MIF表达水平均明显低于治疗无效患者(均P<0.05)。

表3 不同疗效AML患者骨髓液和外周血中

2.3 不同MIF表达水平AML患者DFS比较 以所有患者入院初诊时MIF表达水平中位数为临界值分为高表达组及低表达组。高表达组患者DFS平均(14.25±4.12)个月，低表达组DFS平均(17.56±5.24)个月。高表达组患者DFS低于低表达组(t=4.034，P<0.05)。

2.4 MIF表达水平与AML患者疗效及预后相关性分析 见表4。Spearman相关性分析显示，骨髓液及外周血中MIF表达水平与AML患者疗效及DFS呈负相关(均P<0.05)。

表4 MIF表达水平与AML患者疗效及DFS相关性

3 讨 论

AML为高度异质性疾病，具有细胞增殖快、高侵袭性、预后差等特点[11]。近年来，随遗传及生物学技术的不断发展，临床对AML发病、细胞分化及生物学行为等的认知更为深入，但其发病机制仍无法详细阐明[12]。炎症介质相关表达蛋白可能参与白血病的发病进程，MIF作为其中一种，刘兵华等[13]发现其水平与冠心病患者冠状动脉狭窄程度具有显著相关性，认为MIF通过促进吞噬细胞对低密度脂蛋白的氧化作用而加速血栓形成，使得冠心病患者病情恶化。而江晓珍等[14]研究发现，MIF还可激活磷脂酰肌醇-3-激酶信号通路，促进胶质瘤细胞转移，提示其可能参与肿瘤细胞的分化与增殖。

p53基因为人体抑癌基因的一种，为53 kDa的蛋白质，野生型可在促使癌细胞凋亡的同时控制其增殖分化[15]。但该基因极易突变，可在体外致癌因素诱导下突变，在化疗、氧化应激、内环境改变等一系列生理应激后可激活，发挥致癌作用[16]。研究[17]发现p53基因突变可能与MIF的存在有关。方瑜等[18]认为宫颈癌患者MIF及p53基因表达呈协同作用，这也是MIF参与肿瘤发生与进展的主要原因。本研究结果显示，不同性别及抗原类型的AML患者MIF表达水平相当，表明MIF在AML患者体内表达无性别差异，且不受抗原类型影响。而≥45岁AML患者骨髓液及外周血中MIF表达水平高于<45岁患者，骨髓原始细胞数≥60%的AML患者骨髓液及外周血中MIF表达水平高于<60%的患者，分析可能是因为MIF参与AML的发病与进展，另外骨髓间充质干细胞主要介导白血病细胞分化增殖，具有免疫调节特性，而中老年患者免疫功能下降，骨髓间充质干细胞功能更倾向于恶性生物行为，加重病情发展，导致MIF表达显著升高。

MIF作为多重功能的细胞因子，具有调节糖皮质激素的生理活动、促进炎症反应加剧、造成血管内皮损伤等作用[19]。研究[20]表明，其还可影响细胞分离，并参与癌基因诱导癌细胞的转换过程。张娟娟等[21]发现AML患者MIF高度表达，并证实其可促进骨髓间充质干细胞大量表达白细胞介素-8，加重炎症反应。但既往研究缺乏MIF与AML患者预后相关性的分析，本研究结果显示，经规范化治疗后疗效好的患者骨髓液及外周血中MIF表达水平更低，且MIF高表达的AML患者DFS更低，表明MIF确实随着AML疾病的进展而升高，与其预后具有一定联系。而Spearman相关性分析显示，骨髓液及外周血中MIF表达水平与AML患者疗效及DFS呈明显负相关。MIF的作用方式途径繁多，可通过非经典胞吞、激活磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)1/2、阻止p53基因介导的细胞凋亡等发挥其生物学效应。MIF可参与体内免疫调节、促炎、细胞分裂等病理过程，阻止自然杀伤细胞对白血病细胞的溶解并加速细胞增殖，且MIF可由肿瘤细胞分泌生成，二者互相影响，加重病情恶化。

综上所述，AML患者MIF表达水平较高，且与疗效及患者预后呈负相关。早期检测其表达情况可为临床治疗方案的制定提供可靠依据。然而，AML发病机制相当复杂，p53基因与MIF相互影响的具体机制尚有待进一步探究。