银环蛇伤中毒巴马小香猪模型构建与评估

李亚兰，黄 智，何冬凌，程晓阳，莫财锋，宋天麟，廖 明

(广西医科大学生命科学研究院，广西 南宁 530021)

毒蛇咬伤中毒是发展中国家的一个主要公共卫生问题，全世界每年有180万～270万人被蛇咬伤，至少造成10万人死亡，40万人致残。在我国每年有3万～40万人被蛇咬伤，病死率达5%～10%[1-3]。银环蛇是我国十大毒蛇之一，毒性极强，咬伤中毒致死率居蛇伤首位，病死率为7%～50%[4-6]，如果不及时提供抗蛇毒血清治疗，咬伤后6～30 h即死亡。银环蛇咬伤中毒后，虽局部症状轻微，但由于银环蛇毒主要是神经毒素，如果抢救不及时，病情将迅速恶化，一旦出现呼吸停止，容易造成患者死亡，是急诊科一种常见危急重症[7-9]。目前，对于银环蛇咬伤的研究大多是回顾性的临床急救与护理，对于深入的毒性机制、代谢变化研究较少，特别是缺乏精准的动物模型以支持更深入的基础研究，因此亟待构建一种成熟稳定的银环蛇伤中毒动物模型。巴马小香猪作为我国特有大型哺乳实验动物资源，具有遗传稳定、解剖结构与人类非常类似的优势，近年来被广泛应用于器官移植等实验外科研究[10-11]，然而迄今为止还未见银环蛇伤中毒巴马小香猪模型的构建。本研究首次以巴马小香猪构建银环蛇咬伤中毒动物模型；为最大限度地贴合临床实际，采用了肌内注射银环蛇毒方式；通过分析巴马小香猪生物学行为状态、血常规及血生化指标、组织病理学变化来评估模型的稳定性，以期为银环蛇咬伤中毒基础研究及临床治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 实验动物 KM种小鼠50只，体重18～22 g，由广西医科大学实验动物中心提供，许可证号：SYXK桂2014-0003。健康巴马小香猪24只，体重10 kg左右，由广西大学动物科学院提供，许可证号：SCXK桂2018-0003。所有动物饲养于SPF级环境，室温20～22 ℃，湿度40%～70%，光照12 h明暗交替。本研究根据广西医科大学动物伦理学委员会指导，按照《实验动物管理条例》对动物进行操作。

1.2 主要试剂及耗材 银环蛇毒冻干粉(由广西医科大学蛇毒研究所提供)，0.9%氯化钠注射液(山东省辰欣药业股份有限公司)，5 ml注射器[北仑河(上海)医疗技术有限公司]，一次性真空采血管(平安医疗器械)。

1.3 实验方法

1.3.1 银环蛇毒对巴马小香猪理论半数致死量(LD50)探索：依据文献[12-14]，银环蛇伤小鼠LD100和LD0为肌内注射剂量范围。通过随机数字表法将50只小鼠分为五组，分别为0.1 mg/kg组、0.075 mg/kg组、0.056 mg/kg组、0.042 mg/kg组、0.032 mg/kg组，每组10只，注射相应剂量后连续观察7 d，记录小鼠呼吸暂停时间及生存率。采用概率单位法(Bliss法)计算银环蛇毒对小鼠的LD50，按照体表面积比率换算等效剂量法得出银环蛇毒对巴马小香猪的理论LD50

1.3.2 银环蛇毒对巴马小香猪理论LD50验证：根据1.3.1得出银环蛇毒对巴马小香猪的理论LD50后，将18只健康巴马小香猪随机分为对照组(0.9%氯化钠注射液)、0.12 mg/kg组、0.09 mg/kg组、0.06 mg/kg组、0.03 mg/kg组、0.01 mg/kg组，注射相应剂量后连续观察7 d，记录巴马小香猪呼吸暂停时间及生存率。

1.3.3 银环蛇伤中毒巴马小香猪模型构建与评估：选取健康巴马小香猪6只，随机分为对照组及模型组，每组3只。对照组肌内注射0.9%氯化钠注射液，模型组根据1.3.2结果肌内注射0.03 mg/kg银环蛇毒建立银环蛇伤中毒巴马小香猪模型。通过行为学观察、血液学指标检测和组织病理学研究对模型进行评估。

1.3.3.1 行为学观察：建模后，时刻观察巴马小香猪的生物学行为状态，如精神状态，对刺激的反应，有无呼吸困难、眼睑下垂，是否出现四肢瘫软、口腔分泌物增多等情况。

1.3.3.2 血液学指标检测：分别于注射蛇毒前以及注射蛇毒后3、12、24 h取小香猪前腔静脉血用于检测超敏C反应蛋白(hs-CRP)、肌酸激酶(CK)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、肌酐(Cr)、碳酸氢根(HCO3-)、钾离子(K+)、白细胞计数(WBC)、红细胞计数(RBC)等指标。

1.3.3.3 组织病理学研究：于实验72 h后处死巴马小香猪，采集心、肺、肝、肾及脑组织标本，放入10%福尔马林内固定。固定的标本经充分水洗、酒精脱水和二甲苯透明后，用石蜡包埋，连续切片，切片厚度5 μm，经HE染色后做病理组织形态学检查。

2 结 果

2.1 银环蛇毒对巴马小香猪的理论LD50根据各剂量组小鼠7 d内死亡情况(表1)，采用Bliss法计算出银环蛇毒对小鼠肌内注射的LD50为0.049 mg/kg，95%置信区间为0.03795～0.060012 mg/kg。根据人与动物间体表面积折算的等效剂量比值推算，得出银环蛇毒对巴马小香猪的理论LD50为0.094 mg/kg。

2.2 银环蛇毒对巴马小香猪理论LD50的验证 注射剂量为0.12 mg/kg时，巴马小香猪7 d内病死率为100%；注射剂量为0.06、0.09 mg/kg时，巴马小香猪病死率为66.67%；注射剂量为0.03 mg/kg时，巴马小香猪病死率为33.33%；注射剂量为0.01 mg/kg时，巴马小香猪均未出现死亡。从巴马小香猪肌内注射银环蛇毒剂量对应的病死率来看，由小鼠推断出的银环蛇毒对巴马小香猪的理论LD50可信度较高。同时，参照常规毒理学造模方法、参照银环蛇伤中毒临床病死率7%～50%，以8/25 LD50=0.03 mg/kg作为银环蛇伤中毒巴马小香猪造模剂量。

2.3 两组巴马小香猪行为学变化 与对照组相比，模型组巴马小香猪在注射蛇毒后2 h局部伤口症状表现不明显，但出现嗜睡、运动失调、站立不稳、呼吸加快、口腔分泌物增多、垂涎等全身中毒症状；3 h后出现刺激反应减弱、眼睑下垂、呼吸进一步加重、四肢瘫软；随着中毒时间的推移，12 h后刺激反应极弱、呼吸由快变慢浅、呼吸无力、出现呼吸鸣音、卧地不起。

表1 各组小鼠肌内注射银环蛇毒7 d内死亡情况[只(%)]

2.4 两组巴马小香猪血液学指标比较 见表2。与对照组相比，模型组注射蛇毒后3 h后，WBC、K+显著降低，ALT、Cr、CK及HCO3-显著增加(均P<0.05)；注射蛇毒12 h后，RBC显著增加(P<0.05)；hs-CRP则在注射蛇毒3～24 h内维持升高状态(均P<0.05)。

表2 两组巴马小香猪血液学指标比较

2.5 两组巴马小香猪心肌、肺、脑、肝及肾组织HE染色结果比较 见图1。对照组心肌纤维排列尚整齐，肌纤维无肿胀，细胞核形态、大小均匀；肺泡结构完整，肺泡间隔未见增宽，无炎性细胞浸润；脑组织神经元细胞及星型胶质细胞形态、大小均一正常，核染色质均匀，无明显核周空晕。模型组心肌纤维肿胀，细胞核形态、大小不均匀，可见点状坏死、心肌间质炎性细胞浸润；肺泡结构可见塌陷，肺泡间隔明显增宽，肺泡上皮细胞肿胀，出现浊肿和脂肪变性；脑组织神经元细胞可见急性肿胀、尼氏小体溶解，细胞空泡变形坏死。对照组及模型组巴马小香猪肝肾组织未见明显异常，肝小叶结构清晰完整，肝细胞胞质丰富，肝细胞索排列致密整齐；肾小球无皱缩，肾小囊腔无扩张，肾间质无水肿，间质内无炎性细胞浸润。

3 讨 论

银环蛇属前沟牙毒蛇，毒性剧烈，其蛇毒主要含有α-毒素(α-BTX)、β-毒素(β-BTX)及各种酶等成分。该蛇毒属神经毒素，是一种小分子蛋白质或多肽类，可阻断运动-肌肉接头传导，导致全身肌麻痹、呼吸衰竭[8]。银环蛇伤患者局部伤口无红肿、出血、坏死，但在伤后1～4 h逐渐出现全身性中毒症状，腱反射消失，呼吸困难，尿潴留，严重时出现多系统脏器衰竭，导致呼吸停止[15-16]。根据流行病学调查，在我国银环蛇咬伤占各类毒蛇咬伤的8.2%，居第五位，而死亡人数却居蛇伤首位，尤以华南和华东南部银环蛇咬伤的病死率最高[17-19]。目前，对于银环蛇毒这种急性毒，国内外大多以小鼠、大鼠及兔进行建模来探究银环蛇伤机制，然而小型动物模型具有病程短、不稳定、难以长时间动态分析中毒机制等不足。巴马小香猪作为优良的地方猪种，具有体型小、遗传稳定、性情温和、耐饲养、生理特点与人相似等优点，常作为病理和药理实验的良好载体[20-21]。

A-E：对照组；F-J；模型组。A、F：心肌组织；B、G：肺组织；C、H：脑组织；D、I：肝组织；E、J：肾组织

本研究利用巴马小香猪构建银环蛇伤中毒模型。同时，为判断造模是否成功，进行了行为学观察、血液学及组织病理学分析。巴马小香猪肌内注射银环蛇毒后，局部中毒症状不明显，2 h内出现全身中毒症状，包括嗜睡、运动失调、站立不稳及口角流涎等现象，此症状是由于神经毒素中的α-BTX与终板区胆碱能受体结合，使乙酰胆碱不能作用于N2受体，从而产生了非去极化型神经-肌肉阻断作用[22-23]；3 h后巴马小香猪出现刺激反应减弱、四肢瘫软、呼吸无力等进一步的中毒症状。临床上，银环蛇伤患者早期常无明显症状，一般在3～3.6 h出现首发症状，包括咽痛、上睑下垂、全身肌痛、呼吸困难和吞咽困难，进一步发展将出现腱反射减弱、瞳孔散大、呼吸肌麻痹及四肢瘫痪[24-25]。可见，银环蛇伤中毒巴马小香猪模型基本符合银环蛇神经毒素临床中毒症状。

本研究发现，与对照组相比，注射蛇毒后3 h WBC显著低于对照组，CK、hs-CRP则显著高于对照组，12 h后RBC显著升高，可能是由于银环蛇毒进入血液循环造成中毒感染、呼吸衰竭、心肺组织病变等导致相关血液学指标反馈性异常。ALT、Cr、HCO3-于注射蛇毒后3 h显著升高，K+显著降低，AST未见明显变化，提示蛇毒对于巴马小香猪体内肝肾组织功能可能造成一定影响。病理学结果显示，模型组心肌、肺及脑组织损伤明显，心肌细胞明显排列紊乱，细胞多浑浊肿胀，肺泡间隔明显增宽，其间可见大量炎性细胞渗出，脑组织神经细胞发生肿胀，尼氏小体消失，核偏位。病理组织损伤结果印证了血液学相关指标的变化，与既往研究[7，26-27]结果相一致。

综上所述，以0.03 mg/kg银环蛇毒肌内注射，可以成功构建稳定性好、重复性高、符合临床特点的银环蛇咬伤中毒巴马小香猪模型。