原发性帕金森病及部分帕金森叠加综合征患者肠道炎症及肠道通透性分析

项 志，夏丹豪，秦 驰，孟 琳，田海燕，刘 晗，滕军放

1)郑州大学第一附属医院神经内科 郑州 450052 2)河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室 郑州 450052

原发性帕金森病(idiopathic Parkinson′s disease,iPD)是较为常见的慢性神经系统变性性疾病，其病理特点是黑质纹状体多巴胺神经通路渐进性和选择性变性缺失以及α-突触核蛋白(alpha-synuclein,α-syn)包涵体病理性沉积[1]。该病的发病机制和病理过程尚不明确，目前普遍认为iPD的发生是遗传因素和环境因素共同作用的结果[2]。帕金森叠加综合征(Parkinson plus syndrome,PPS)是一系列临床症状与iPD相似，但病理表现不同的神经变性性疾病，以多系统萎缩(multiple system atrophy,MSA)、路易体痴呆(dementia with Lewy body,DLB)居多。错误折叠的α-syn在神经系统内异常沉积并在细胞内形成病理性包涵体是iPD、MSA、DLB共同的病理特征，因此该类疾病被统称为α-syn病[1-2]。大量体内外研究[1,3]发现，α-syn包涵体在神经系统内形成并播散是α-syn病的主要致病机制。近年来，有学者[4]提出，肠道微生态环境紊乱可能在中枢性α-syn病病理进展中发挥重要作用。此外，临床研究[5]发现iPD及PPS患者多伴有明显的胃肠道症状，并且多为患者的首发症状。已有研究[6]表明，iPD患者的肠道通透性高于正常人群，结肠活检结果显示组织中炎症细胞因子表达量明显增高。鉴于iPD、MSA、DLB具有相似的病理表现，我们猜想肠道炎症反应和肠道通透性改变可能是iPD及部分PPS共有的特征，并且在疾病的发生和病程进展中发挥重要作用。本研究通过检测iPD、MSA、DLB患者血浆和粪便中炎症标志物水平以及粪便和结肠组织肠道通透性标志物，并通过病理活检观察肠道黏膜组织结构和病理改变，进一步探索肠道微生态环境改变在iPD及部分PPS病程进展中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2018年9月至2020年6月于郑州大学第一附属医院神经内科门诊就诊及住院的52例iPD、28例MSA、21例DLB患者，均由两位神经内科运动障碍方面的专家共同诊治。纳入标准：①iPD符合国际帕金森病和运动障碍协会(MDS)2015年帕金森病的临床诊断标准[7]；MSA符合2008 年修订的Gilman诊断标准[8]；DLB符合2005年DLB国际研究协作组提出的诊断标准[9]。②无胃肠道疾病病史和胃肠手术史。③近3个月无抗菌药物、胃肠药物、益生类食物或饮品服用史。④饮食习惯为杂食，无其他特殊饮食习惯。⑤无创伤性脑损伤史、脑肿瘤、其他神经系统疾病。⑥接受抽血及粪便收集、检查。35名健康对照来自门诊招募，入组标准：①未被诊断过帕金森病、其他神经或精神疾病。②～⑥同上述。iPD、MSA、DLB患者各8例接受结肠活检，健康对照组有5人接受结肠活检。活检前1周均未服用抗凝药物和抗血小板药物，均无肠道活检禁忌证。所有受试者均进行全面的病史采集，包括性别、年龄、症状、起病时间、家族史、工作性质、生活环境、吸烟饮酒史、中毒史、外伤史、神经系统病变危险因素接触史、其他慢性疾病史等。iPD患者的疾病严重程度由HoehnYahr(H-Y)分期进行评价，MSA患者的疾病严重程度由UMSARS评分进行评价，DLB患者的疾病严重程度由简易智力状态检查量表(Mini-mental State Examination，MMSE)进行评价。本研究通过郑州大学第一附属医院伦理委员会审批。136人均为自愿参与本研究，参与结肠活检者均签署知情同意书。

1.2 血浆和粪便中肠道炎症及肠道通透性指标的检测血浆标本的收集：健康对照者晨起空腹取血，iPD、MSA、DLB患者入院后次日晨起空腹取血3 mL，肝素抗凝，静置1～2 h，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，取上清。-80 ℃冰箱中保存备用。

粪便标本的收集及预处理：iPD、MSA、DLB患者入院后次日使用干净的集便器采集粪便标本，健康对照者留取粪便，装入灭菌的冻存管，并于2 h内转移至-80 ℃冰箱保存备用。使用无菌接种环取500 mg粪便标本置于试管内，加入50 mL PBS，充分振荡混匀，取2 mL，14 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL PBS洗涤，收集沉淀，重复3次。标本预处理完成后，存于-80 ℃冰箱备用。

ELISA：用ELISA试剂盒(Elabscience公司)分别检测血浆中肠道炎症标志物内毒素结合蛋白(lipopolysaccharide-binding protein，LBP)水平，粪便中肠道炎症标志物粪钙卫蛋白(fecal calprotectin，FC)、肠道通透性标志物粪α-1-抗胰蛋白酶(fecal alpha-1-antitrypsin，FAT)和粪连蛋白(fecal zonulin，FZ)水平，严格按照试剂盒说明书操作。连续检测3次，取均值。

1.3 结肠黏膜组织中肠道通透性指标的检测根据消化内科内镜处的标准程序进行结肠镜检查及活检。使用标准活检钳(MTN-BF-23/16-A，南京Micro-tech公司)采集活组织标本，每位受检者于升结肠处分别取3块黏膜组织。标本收集完成后用生理盐水充分清洗，快速置于福尔马林中固定及液氮低温冻存。

免疫组化染色：取标本，常规梯度乙醇脱水，石蜡包埋，4 μm厚切片。60 ℃烘片2 h后取出，经二甲苯脱蜡和梯度乙醇脱水透明，PBS清洗3次，每次5 min。玻片置于枸橼酸钠缓冲液中进行高温高压抗原修复5 min,冷却后PBS洗涤1次，5 min；体积分数为3%的Triton溶液孵育30 min，PBS洗涤3次，每次5 min；山羊血清封闭液封闭30 min，加入一抗工作液，抗Occludin抗体、抗ZO-1抗体(Thermo公司)均按1∶200稀释，抗E-cadherin抗体(Abcam公司)1∶600稀释，抗磷酸化α-syn(Pα-syn)抗体(Millipore公司)1∶300稀释，湿盒内4 ℃孵育24 h。室温下复温1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；辣根过氧化物酶标记的二抗工作液(羊抗鼠 IgG，北京博奥森公司，1∶1 500稀释)孵育30 min，PBS洗涤3次。DAB显色,苏木精复染,梯度乙醇脱水，二甲苯透明，甘油封片。使用Olympus BX43显微镜观察并拍照(×400)，每张切片选取3个视野，使用Image J软件统计免疫阳性染色(棕黄色)面积百分比。

免疫荧光双标染色：取标本，同上石蜡包埋、切片、修复抗原、Triton溶液孵育后，加入一抗工作液，抗Occludin抗体和抗ZO-1抗体(Thermo公司)按1∶600稀释，抗Pα-syn抗体(Abcam公司)1∶800稀释，肠道神经纤维标志物抗PGP9.5抗体(Abcam公司)1∶600稀释，湿盒内4 ℃孵育24 h。室温下复温1 h，PBS洗涤3次，每次5 min；加荧光二抗避光孵育3 h，PBS洗涤3次，每次10 min；Hochest33258染色液(1∶1 000稀释，北京索莱宝公司)染核，PBS洗涤1次5 min，甘油封片。使用Olympus BX43显微镜观察并拍照。

1.4 统计学处理用SPSS 22.0处理数据。多组间年龄、病程，结肠黏膜组织中Occludin、ZO-1、E-cadherin、Pα-syn表达水平的比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验；采用Kruskal-Wallis秩和检验比较多组间血浆中LBP水平，粪便标本中FC、FAT、FZ水平的差异，两两比较采用Bonferroni法；采用χ2检验分析多组间性别、Pα-syn染色阳性率的差异。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 4组基本资料的比较结果见表1。由表1可知，各组间年龄、性别、病程差异均无统计学意义(P>0.05)。iPD组H-Y评分为2.30±0.67，MSA组UMSARS评分为32.25±11.26，DLB组MMSE评分为14.72±5.41。

表1 4组基本资料的比较

2.2 4组血浆及粪便中肠道炎症及通透性标志物表达水平的比较与健康对照比较，iPD、MSA患者血浆LBP水平降低，粪便中FC、FAT、FZ水平升高(表2)。

表2 4组血浆LBP和粪便FC、FAT、FZ水平比较

2.3 4组结肠黏膜组织中肠道通透性指标及Pα-syn的表达免疫荧光双标染色结果(图1)显示：Occludin和ZO-1在健康对照和DLB患者肠道黏膜中沿细胞膜均匀分布，光滑连续；在iPD和MSA患者肠道黏膜中沿细胞膜不连续分布，表达水平明显降低。iPD、MSA、DLB患者肠道黏膜中Pα-syn沉积于神经元(PGP9.5标志)内。健康对照组、iPD组、MSA组、DLB组Pα-syn阳性率分别为20.0%(1/5)、62.5%(5/8)、37.5%(3/8)、50.0%(4/8)，4组间比较，差异无统计学意义(χ2=2.517，P=0.472)。与健康对照比较，iPD、MSA患者结肠黏膜组织中Occludin、ZO-1、E-cadherin表达水平降低，iPD、MSA、DLB患者Pα-syn大量沉积(图2、表3)。

A、B、C、D：分别为健康对照，iPD、MSA、DLB患者图1 iPD、MSA、DLB患者及健康对照结肠黏膜组织免疫荧光双标染色(×400)

A、B、C、D：分别为健康对照，iPD、MSA、DLB患者图2 iPD、MSA、DLB患者及健康对照结肠黏膜组织免疫组化染色(SP，×400)

表3 4组结肠黏膜组织中Occludin、ZO-1、E-cadherin、Pα-syn表达水平的比较 %

3 讨论

帕金森病的肠道起源学说近年来日益受到重视。大量研究[10-11]发现Pα-syn阳性包涵体在iPD患者中沿肠神经系统病理性沉积，且早于中枢症状出现。遗传学研究[12-13]显示，部分iPD和炎症性肠病患者(如溃疡性结肠炎、克罗恩病)具有相同的遗传背景，炎症性肠病患者中帕金森病的发病率明显高于健康人群。此外，研究[14]表明，肠道菌群紊乱会加重帕金森病小鼠模型的症状和病理表现。Braak等[15]提出的α-syn在肠道中沉积并沿迷走神经逐渐向上播散至中枢神经系统引起帕金森病表型的理论为此学说奠定了基础。此外，肠道微生态的改变可能在帕金森病的发病与病程进展中发挥重要作用[4,16]。

肠-脑轴的提出为α-syn病的研究提供了新思路。Devos等[17]发现iPD患者早期即有明显的肠道炎症反应。动物实验[18]证明，在帕金森病模型小鼠中，外源性给予化学致炎物质后，小鼠的行为学改变明显提前，并且提前表现出肠道和脑神经元内α-syn病理性沉积、纹状体和黑质多巴胺能神经元数量减少以及肠道和脑中炎症标志物水平升高。以上研究表明，肠道炎症改变可能会加重iPD的病理变化。基于iPD、MSA、DLB相似的病理特征，我们推测肠道炎症和肠道通透性增加可能是iPD和部分PPS共同的病理变化，并且可能会促进疾病进展。

LBP是一种与LPS结合的急性期蛋白[19]。血浆LBP水平可以反映全身细菌LPS暴露情况[20]。FC由活化的中性粒细胞释放，是肠道炎症的敏感粪便标记物，可以反映亚临床炎症；而FAT和FZ是反映肠道黏膜完整性的敏感指标[21]。肠黏膜屏障是保护肠道免受有害物质侵入的重要结构，主要由肠上皮细胞和细胞间连接构成，细胞间连接由紧密连接、缝隙连接、黏附连接和桥粒连接等组成，其中紧密连接最为重要，Occludin和ZO-1是构成肠上皮细胞紧密连接的主要蛋白；E-cadherin水平可以反映肠上皮黏附连接的功能状况[22]。我们发现iPD、MSA患者血浆LBP水平低于健康对照组，粪便中FC、FAT、FZ水平均高于健康对照组，结肠肠道通透性增加，由此进一步证明了iPD、MSA患者存在肠道炎症且肠黏膜屏障受到破坏。我们的研究虽然未能证明肠道改变是发生于iPD、MSA发病之前还是继发于iPD、MSA之后，但是既往的研究[23]显示，肠道炎症和通透性改变可能早于中枢神经系统病变出现，并且在促进iPD和PPS的疾病进程中发挥重要作用。

肠道LPS暴露介导的炎症级联反应可以诱导局部和全身炎症改变，引起促炎因子分泌以及氧化应激水平增加，进而引起中枢神经系统病变[24]。有研究[19,25]提出，iPD可能是由一种破坏肠黏膜屏障的环境病原菌所引起，肠道中潜在的嗜神经物质侵入黏膜下神经丛，进一步通过迷走神经节前神经播散至中枢神经系统，炎症反应也可以通过迷走神经播散至下脑干，进而通过基底中脑和前脑，到达大脑皮层，导致iPD病理性改变。我们发现Pα-syn在iPD、MSA、DLB患者肠道神经元内广泛沉积，可能与肠道炎症反应及通透性改变有关，这仍需要进一步的实验证实。同时，关于DLB是否伴有肠道结构和功能改变亦需要进行进一步研究证明。

综上所述，肠道炎症反应和肠道通透性改变与iPD及PPS疾病病程进展有关。该结论为寻找iPD及部分PPS早期诊断标志物提供了新思路。改善肠道微环境有望成为改善iPD及部分PPS症状、延缓疾病进程的手段。