延龄草苷对过氧化氢诱导的PC12细胞凋亡的保护作用及机制

2021-12-14 09:29唐鲜娥何一多陈颖夏德尧覃晓莉赵方毓王凤杰陈显兵
湖北民族大学学报(医学版) 2021年4期
关键词:百分比脊髓神经元

唐鲜娥,何一多,陈颖,夏德尧,覃晓莉,赵方毓,王凤杰,陈显兵*

1.湖北民族大学医学部(湖北 恩施 445000) 2.湖北民族大学附属民大医院病理科(湖北 恩施 445000)

脊髓损伤(Spinal Cord Injury,SCI)是由脊柱骨折或脱位引起的脊髓或马尾神经的损伤。我国SCI患者超过100万,患病人数逐年递增,感觉运动功能的完全或部分消失严重影响SCI患者的生活质量和生存寿命[1]。目前临床尚无特效药,主要包括手术减压和稳定、神经保护药物等治疗[2]。研究表明[3]SCI继发性损伤时期的病理生理变化可促进神经元的凋亡,抢救损伤边缘区域的神经元对于神经功能修复至关重要,神经元凋亡成为SCI的重要发病机制之一。延龄草苷(Trillium Tschonoskii Maxim,TTM)具有抗癌、抗炎、免疫调节、清除氧自由基等功效,可通过上调脊髓组织中的睫状神经营养因子(CNTF)和睫状神经营养因子受体-α(CNTFR-α)对SCI起保护作用[4]。然而延龄草苷对过氧化氢(H2O2)诱导的肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞株(PC12)细胞损伤是否具有保护作用以及其潜在机制尚无文献报道。本研究以H2O2诱导PC12细胞损伤构建神经细胞损伤模型,观察TTM是否对H2O2诱导PC12细胞损伤具有保护作用,并初步探讨TTM是否通过抑制凋亡从而减轻H2O2诱导的PC12细胞损伤,揭示TTM是否具有作为SCI治疗的潜力。

1 材料与方法

1.1试剂TTM(CAS No.14144-6-0,Bellancom)订购于北京环球材料有限公司,高效液相色谱(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)测定其纯度大于98%,用二甲亚砜(DMSO)溶解TTM形成80 mmol/L的储备溶液于-20°C保存,使用前将原液稀释至所需浓度。MTT试剂盒、ANNEXIN V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自Solarbio(索莱宝,中国北京),Bcl-2、Bax、Cleaved-Caspase-3一抗购自赛信通(上海)生物试剂有限公司,二抗购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2细胞培养大鼠PC12购自中国典型培养物保藏中心(中国武汉)。正常对照组的PC12细胞不做任何处理。H2O2损伤组以300 μmol/L H2O2处理细胞15 min,再换成普通培养液继续培养,H2O2+TTM(6.25 μmol/L)、H2O2+TTM(12.50 μmol/L)组、H2O2+TTM(25.00 μmol/L)组分别用300 μmol/L H2O2预处理细胞15 min后,换成相应浓度梯度的TTM处理细胞24 h。细胞培养基选用DMEM,加入10%灭活胎牛血清(FBS)、青霉素(100 U/mL)和链霉素(0.1 mg/mL),置于CO2培养箱(37℃,5%CO2)。

1.3 MTT法检测细胞活力将PC12细胞接种于96孔培养板,每孔细胞数约为10 000个,加DMEM并于37℃孵育,使用不同浓度梯度的H2O2(0、50、100、200、300或400 μmol/L)诱导PC12细胞损伤,MTT法测定细胞活力以确定最佳剂量的H2O2。24 h后在DMEM培养基中加入浓度梯度的TTM(0、6.25、12.50、25.00 μmol/L)并孵育24 h。每孔加入20 L 0.5%MTT溶液,继续培养3 h后每孔加入DMSO充分溶解MTT结晶甲瓒。使用酶联免疫检测仪(Thermo Scientific,Multiskan Go,Waltham,MA,USA)OD490 nm处测量各孔的吸光值,通过对照孔测得的信号百分比表示细胞活力。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)凋亡检测试剂盒通过流式细胞术检测细胞凋亡。凋亡早期的PC12细胞使用荧光素FITC标记的膜联蛋白V(Annexin-V)染色,使用PI染色观察凋亡中晚期的细胞和死亡细胞。在细胞悬浮液(100 μL)中加入5 μL的Annexin-V,再加入5 μL的PI,4 ℃下避光反应15 min后,细胞悬液中加入400 μL缓冲液,1 h内在流式细胞仪上机检测(FACScalibur,Becton Dickinson,美国加利福尼亚州圣何塞),以细胞总数的百分比表示凋亡细胞的比例。

1.5蛋白质提取和蛋白质印迹分析PC12细胞处理后弃去培养基,用蛋白质提取试剂盒(Beyotime,中国上海)提取蛋白质,BCA试剂盒测定蛋白浓度,加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,100℃变性5 min。提取蛋白定量后按照30 μg蛋白量上样,进行SDS-PAGE电泳(8%分离胶、5%浓缩胶),PVDF膜湿转,用5%封闭液(脱脂奶粉5 g+TBST100 mL)在室温封闭1 h。加入一抗4℃孵育过夜,TBST洗涤后加入酶标二抗室温孵育1 h。化学发光(ECL)显色后利用AlphaView SA软件中的Analysis Tools-Multiplex Band Anaysisregion、选取测定的蛋白条带,使用软件ImageJ进行半定量分析。内参为β-actin。

2 结果

2.1 H2O2诱导的PC12细胞活力及凋亡相关蛋白的检测与正常对照组比较,H2O2的浓度为300 μmol/L时PC12细胞活力显著降低(P<0.01),而浓度为50 μmol/L时PC12细胞未出现明显损伤(图1A)。相较于正常对照组,H2O2损伤组凋亡细胞的百分比显著增高(P<0.01,图1B),H2O2损伤组晚期凋亡细胞比例与正常对照组相比,从4.34%上升到6.06%。Western blot结果显示,H2O2损伤组Bcl-2的表达水平降低(P<0.01),Bax和Cleaved-caspase3的表达水平显著升高(P<0.05;P<0.01)(图1C)。

注:A. MTT测定细胞活力;B.流式细胞术分析测试凋亡细胞的百分比;C.蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白的表达;与正常对照组比较,*:P<0.05,**:P<0.01。图1 H2O2诱导PC12细胞的细胞活力降低及细胞凋亡增强

2.2 TTM对H2O2诱导的PC12细胞的细胞活力及凋亡相关蛋白的影响如图2A所示,相较于H2O2处理组,TTM浓度为12.50 μmol/L时能够显著提高细胞活力(P<0.01),且凋亡细胞百分比显著降低(P<0.01)(图2B),H2O2+TTM(12.50 μmol/L)组晚期凋亡细胞比例与H2O2处理组相比,从17.2%下降到5.13%。Western blot结果显示,H2O2+TTM(12.50 μmol/L)组Bcl-2的显著升高(P<0.01),Bax和C-caspase-3的表达水平显著降低(P<0.01;P<0.05)(图2C)。

注:A. MTT测定细胞活力;B.流式细胞术分析测试凋亡细胞的百分比;C.蛋白质印迹检测凋亡相关蛋白的表达;与正常对照组比较,*:P<0.05,**:P<0.01;与H2O2损伤组比较,#:P<0.05,##:P<0.01。图2 TTM抑制H2O2诱导的PC12细胞损伤及细胞凋亡

3 讨论

临床上SCI主要表现为损伤平面以下部位的运动和感觉功能障碍。在全球范围内SCI的发病率、致残率呈逐年增高趋势,为社会、家庭带来巨大负担。发现H2O2诱导了细胞凋亡,而TTM可逆转H2O2诱导的细胞损伤,抑制细胞凋亡,TTM对损伤PC12细胞具有保护作用,其机制尚不清楚。

急性SCI机制复杂,由瞬间机械力导致的原发性损伤可引起神经元结构功能发生不可逆损伤,而于原发性损伤之后发生的继发性损伤对人体具有更大的危害性[1],凋亡在急性SCI中起着重要作用,氧化应激可能通过引起脂质过氧化、改变蛋白和DNA氧化/氧化还原的状态,促进神经细胞凋亡[5]。其他所涉及的机制包括脂质过氧化、自由基损伤、氨基酸毒性作用、血管痉挛、钙离子介导的细胞水肿、电解质失调、炎症反应、细胞调亡,以及损伤后基因表达的改变等。本研究中使用300 μmol/L H2O2作用PC12细胞可显著降低其细胞活力,提高凋亡中晚期凋亡细胞的百分,因此本次实验中H2O2作用于PC12细胞的最终浓度为300 μmol/L,H2O2可诱导PC12细胞凋亡。

凋亡与包括SCI在内的多种神经退行性疾病有关,而抑制神经元凋亡在SCI治疗中拥有较广泛的前景[6-9]。Bcl-2蛋白家族控制的内在细胞死亡通路是启动细胞凋亡的主要方式之一[10],包括抗凋亡成员Bcl-2、Bcl-X(L)和促凋亡成员Bax、Bak、Bad,通过激活调控细胞凋亡的关键蛋白酶Caspase-3,从而进行大规模蛋白水解导致细胞凋亡[11]。本研究表明,H2O2作用于PC12细胞后其细胞凋亡百分比显著增高,促凋亡蛋白Bax与Cleaved-caspase3表达水平上调,抗凋亡蛋白Bcl-2低表达,提示H2O2诱导了PC12细胞凋亡。过去的研究显示[12],在SCI大鼠损伤脊髓组织中,神经元的凋亡水平显著升高,由Nrf2/ARE通路介导的体内氧化应激参与了SCI大鼠神经元的损伤。以上研究结果提示,凋亡参与了SCI发生发展,通过调控凋亡的水平有机会抢救损伤边缘的神经元,从而改善SCI患者的预后。

头顶一颗珠(TTM)又名延龄草,主要化学成分以皂苷为主包括甾体皂苷、黄酮苷、倍半萜苷、苯丙素苷,具有免疫调节、清除氧自由基DPPH、抑制脂质的过氧化反应,改善心功能和降压、抗衰老等功效。本研究中,H2O2可诱导PC12凋亡,而TTM可显著提高H2O2作用后的PC12细胞活力,降低凋亡细胞百分比。另外,从蛋白水平上证实了TTM可上调抗凋亡蛋白Bcl-2,下调促凋亡蛋白Bax以及C-caspase-3,然而TTM通过抗凋亡改善神经元损伤的具体机制尚不十分清楚。有研究显示,TTM可以提高抗氧化酶活性、抑制脂质的过氧化反应、改善SCI大鼠的运动功能。提取液还可通过提高损伤心肌中的SOD、GPx活性和降低MDA含量,抑制糖尿病大鼠心肌损伤中的心肌细胞凋亡[13]。另外TTM在上调脊髓组织中CNTF和其受体表达的同时,还显著降低损伤脊髓组织中的SOD及ROS的产生,抑制凋亡,通过Nrf2/ARE途径抑制体内氧化应激反应保护损伤脊髓中的神经元细胞[12],TTM在遭受SCI的大鼠中具有神经保护功效[14]。有研究显示[4,14-15]TTM对SCI大鼠的保护作用与nBax和caspase-3表达的降低有关。以上结果说明,TTM能够抑制H2O2诱导PC12胞氧化应激及细胞凋亡,减轻H2O2毒性,这可能与观察到的Bcl-2表达上调和裂解的caspase-3上调相关,分析其原因可能是由于SCI发生后,导致PC12细胞内ROS积聚、MDA的产生,降低SOD、GSH-Px活力,胞质中Nrf2与Keap1所形成复合体被破坏,Nrf2转位至细胞核内与ARE序列结合,促进抗氧化酶的表达氧化应激活化Nrf2/ARE通路,Bcl-2蛋白家族控制的内在细胞死亡通路。TTM对H2O2诱导的PC12细胞损伤具有保护作用,这一保护作用可能通过抑制细胞凋亡实现。

通过本研究验证了TTM对H2O2诱导的PC12细胞损伤起保护作用,TTM有望成为SCI的潜在治疗药物,为寻找SCI的潜在治疗靶点提供了依据,然而TTM抑制凋亡保护神经细胞损伤的具体分子通路及药物作用靶点尚待进一步研究。

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