腐霉利人工抗原制备研究

胡骁飞，邢云瑞，孙亚宁，庞杏豪,，王 耀

（1河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，郑州 450002；2河南科技大学食品与生物工程学院，河南洛阳 471023）

0 引言

随着国家法律法规的逐步健全及食品安全监控检测技术的进步与发展，近年来，中国食品安全水平得到大幅度地提高。然而食品安全生产是一个涉及范围广泛的产业，影响因素复杂多样。农药残留超标是其中一个重要影响因子。腐霉利(PCM)是一种杀菌剂类的农药，商品名称速克灵，扑灭宁，杀霉利，环丙胺，扑灭酮，菌核利等，主要用于防治作物、蔬菜、水果的菌核病，灰霉病，黑斑病等[1-4]。PCM良好的抗菌作用使其在世界范围得到广泛应用，而其在作物中的残留对人及动物均会产生危害[5-7]。为了减少PCM通过食物链危害消费者健康，世界多国均对食品中PCM制定出最高残留限量标准，中国食品安全国家标准GB2763-2016也对不同的蔬菜及食品中PCM残留确定了最高限量标准，比如韭菜中限量为200µg/kg，食用植物油中为500µg/kg。为了能够有效地监控检测食品中PCM残留，研究人员建立了各种PCM检测方法，主要是理化检测方法，包括色谱法及其衍生方法，如高效液相色谱法[8]，二极管阵列检测器与高效液相色谱联用法[9-10]，反相高效液相色谱法[11]，气相色谱法[12]，气相色谱电子俘获器检测法[13-14]；色谱质谱联用，如气相色谱质谱联用法[15-16]，气相色谱-串联质谱法[17-18]；近红外光谱法[19]；毛细管电泳法[20-21]等。理化检测方法灵敏度高，检测结果准确，重现性好，因此往往被作为标准检测方法。但理化检测方法耗时比较长，仪器昂贵，样品前处理比较复杂，限制了其普及应用。免疫学检测方法灵敏度高，检测速度快，因而在农药残留检测领域得到广泛应用。但对于PCM检测的免疫学方法还比较少，邹强等[22]制备PCM单克隆抗体建立了相应的阻断ELISA检测方法，灵敏度（半数抑制浓度IC50）为71ng/mL。尽管这一灵敏度可以满足中国检测农作物、蔬菜、水果中PCM最高残留限量要求，但如果用于制备更快速、简单的免疫学检测试纸时，考虑到样品中PCM提取率，样品基质效应消除等因素，其灵敏度可能无法满足需求。因此，需要制备更灵敏的PCM单抗隆抗体，以便用于研制高灵敏度的PCM检测试纸。本研究拟利用琥珀酸酐法对PCM进行分子改造，然后采用碳二亚胺法将改造后的PCM与载体蛋白进行偶联制备PCM的人工抗原，并对其质量进行鉴定，为PCM抗体的制备及后续免疫学检测方法的建立奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验试剂、动物与仪器

1.1.1 试验试剂、动物 PCM购自阿拉丁生化科技股份有限公司。弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)购自Sigma公司。1-乙基-3-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺(EDC)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购自 Thermo Fisher Scientific（中国）公司。羊抗鼠酶标二抗(GaMIgGHRP)购自华美生物工程有限公司。无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、琥珀酸酐(SA)等常规试剂均是分析纯级或更高级，由市场采购。0.01 M pH 7.4磷酸盐缓冲液(PBS)，洗涤液(PBS+0.005%Tween-20,PBST)，0.05M pH 9.6碳酸盐缓冲液(CBS)，双蒸水(DDW)，均由实验室自备。BALB/c小鼠，购自郑州大学医学院实验动物中心，由河南省农业科学院动物免疫学重点实验室实验动物中心饲养。本试验于2020年1—9月在河南省农业科学院动物免疫学重点实验室进行。

1.1.2 仪器 NanoDrop One微量分光光度仪（Thermo Fisher Scientific公司），MS 3B涡旋震荡器（德国IKA公司），ME204E万分之一电子天平（德国Mettler Toledo公司），HI9321 pH计（美国Hanna公司）。550酶标仪（美国Bio-Rad公司）。

1.2 PCM人工抗原的合成

采用琥珀酸酐法改造PCM分子，EDC法将其与载体蛋白偶联，具体路线见图1。

图1 PCM分子改造及人工抗原合成路线图

称取PCM 21.7 mg，琥珀酸酐7.6 mg，溶于1 mL无水DMF中混合均匀，再加入无水三氯化铝26.7 mg，此时溶液为无色澄清溶液。室温搅拌反应120 h。

向上述溶液中加入5 mL DDW，测定溶液pH。加入1 mL二氯甲烷，震荡后静置5 min，弃上层水相，留下层有机相。再向有机相中加入5 mL DDW，震荡后静置5 min，弃上层水相，留下层有机相。重复上述操作4次，相当于水洗二氯甲烷（有机相）5次。把有机相用氮气吹干，得到改造后的PCM-SA。

2 mL DMF溶解PCM-SA，然后加入22.0 mg EDC，13.4 mg NHS，混匀后得澄清溶液。取出1 mL，向其中加入1 mL含有50.5 mg BSA的DMF溶液。剩余的PCM-SA溶液中加入1 mL含有33.9 mg OVA的DMF溶液。反应4 h，对PBS透析72 h，4～8 h换透析液一次。收集透析后的溶液，5000 r/min，离心5 min，留上清，弃沉淀。NanoDrop one测定上清浓度，测定6次。

1.3 PCM人工抗原的鉴定

1.3.1 紫外扫描鉴定 把制备好的人工抗原PCM-SABSA，BSA溶液及PCM溶液用PBS稀释到大致相同的浓度。用NanoDrop One微量分光光度仪扫描紫外吸收光谱，对比PCM-SA-BSA、BSA和PCM间紫外吸收的最大吸收峰位置的偏移，根据最大吸收峰是否偏移来初步分析PCM人工抗原是否制备成功[23]。

1.3.2 SDS-PAGE凝胶电泳鉴定 十二烷基硫酸钠(SDS)是常用的阴离子表面活性剂，能够让蛋白质的氢键和疏水键断开，并消除不同种类蛋白质间本来的电荷差异，使蛋白质电泳迁移率只受蛋白质分子量决定。十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)是蛋白质分离鉴定的最常用的方法。采用5%(w/v)的浓缩胶和10%(w/v)的分离胶，考马斯亮蓝染色，以冰醋酸-甲醇溶液为脱色液脱色[24]。

1.3.3 动物免疫 选取3只6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠，用PCM-SA-BSA进行免疫，免疫剂量为每只小鼠每次200µL含有5µg人工抗原的乳化液。背部皮下4点注射。免疫间隔3～5周。共免疫4次。首次免疫，将人工抗原用灭菌的PBS稀释到10µg/mL，然后加入等量的FCA，完全乳化后注射。以后3次免疫，均是用FIA取代FCA，其他试剂用量及过程不变。

第4次免疫10天后，断尾采血10µL，加入到990µL PBS中，5000 r/min离心10 min，弃沉淀，留上清用于测定血清效价及敏感性。

采用间接ELISA测定血清效价；间接竞争ELISA测定血清敏感性[24]，甲醇溶解的PCM用PBS分别稀释到256、128、64、32、16、8、4 µg/mL及2 µg/mL，进行血清敏感性测定。

2 结果与分析

2.1 人工抗原的紫外扫描鉴定

由图2可以看出，BSA吸收峰在278 nm处，与PCM偶联后，PCM-BSA吸收峰发生了改变，吸收峰在277 nm处，初步证明PCM-BSA偶联在了一起。

图2 PCM人工抗原紫外扫描结果

2.2 人工抗原的凝胶电泳鉴定

SDS-PAGE目的是区分分子量大小不同的蛋白质，分子量大的蛋白质移动速度慢，分子量小的蛋白质移动速度快。由图3可以看出，PCM-BSA在电泳时移动速度比BSA要慢一些，说明其分子量比BSA要大一些，进一步证明PCM与BSA成功偶联在一起。

图3 PCM人工抗原凝胶电泳结果

2.3 免疫小鼠血清效价

由表1可以看出，制备的人工抗原免疫小鼠后，3只小鼠血清均产生抗体针对PCM-OVA抗体，抗体效价最高可达1:6400，说明PCM与载体BSA偶联在了一起，并且能够刺激机体产生抗体。

表1 PCM-BSA免疫小鼠血清效价(n=2)

2.4 血清敏感性

由表2可以看出，用游离的PCM与包被的PCMOVA竞争结合小鼠血清抗体时，并没有产生明显的抑制现象，同一小鼠血清、不同浓度PCM的酶标板孔的OD450值没有出现有序的随PCM浓度降低而增加的现象，说明PCM-BSA免疫小鼠产生的血清虽然与PCMOVA发生反应，但与PCM并不反应。这可能是因为人工抗原制备过程中，破坏了PCM的抗原决定簇，导致了PCM-BSA免疫小鼠的血清，可以与PCM-OVA反应，但不能识别PCM。为了证明这种可能性，把制备的PCM-OVA溶液倍比稀释与酶标板上包被的PCMOVA竞争结合小鼠血清，测定各酶标板孔OD450值的变化，结果见表3。由表3的结果可以看出，随着PCMOVA溶液稀释倍数的增加，也即随着PCM-OVA浓度的降低，酶标板孔的OD450值逐渐增加，说明游离的PCM-OVA能与酶标板包被的PCM-OVA竞争结合小鼠血清。

表2 PCM-BSA免疫小鼠血清敏感性(n=2)

表3 PCM-OVA替代PCM测定小鼠血清敏感性(n=2)

3 讨论

PCM分子量为281.14，属于小分子半抗原物质，其只有反应原性而缺少免疫原性，也即其本身不能刺激动物机体产生抗体，必须与载体蛋白如BSA、OVA、匙孔血蓝蛋白(KLH)等偶联制备人工抗原，才能刺激动物机体产生抗体。不同的小分子半抗原物质根据其分子结构的不同而采用不同的偶联方法，如碳二亚胺法，混合酸苷法，活泼酯法，重氮化法等[25]来制备其人工完全抗原。从分子结构上看，PCM本身没有可以和蛋白质氨基或羧基直接相连的位点，因此本研究中对其结构进行了改造，通过琥珀酸酐法改造在分子结构上引入羧基基团，然后分别与载体蛋白BSA，OVA偶联在一起，其中PCM-BSA作为人工免疫原来免疫小鼠产生抗体，而PCM-OVA作为包被原，包被酶标板测定PCM-BSA免疫小鼠的血清效价及血清敏感性。

有许多方法可以用来鉴定所制备的小分子半抗原物质的人工抗原质量，而SDS-PAGE、紫外扫描、动物免疫是常用的3种鉴定方法[24,26]。本研究中，紫外扫描结果表明，PCM-BSA紫外吸收峰与BSA的吸收峰有所不同，初步证明PCM与BSA成功偶联在一起。而SDS-PAGE结果表明，PCM-BSA在胶板上电泳的速度较BSA慢一些，说明PCM-BSA分子量比BSA分子量大，也证明PCM与BSA成功偶联在一起。但上述这2种方法的结果只是简单证明了PCM偶联到载体蛋白BSA分子上，但并不能确定人工抗原的分子构象，也不能确定PCM是否正确偶联到载体蛋白上，更不能确定人工抗原制备过程中是否破坏了PCM的抗原决定簇。而一旦PCM抗原决定簇破坏，即使PCM-BSA能够刺激机体产生抗体，但抗体也不能与PCM发生免疫结合反应。

小分子半抗原是否正确地与载体蛋白偶联且保持抗原决定簇没有被破坏，最有效的证明方式就是用制备的小分子的人工抗原免疫动物如小鼠、大白兔等，测定动物产生的抗血清是否与小分子产生免疫反应[27]。用PCM-BSA免疫小鼠时，血清中也含有BSA的抗体，但在由于检测血清效价时，包被在酶标板上的人工抗原载体蛋白是OVA，不是BSA，因此可以排除检测到的血清抗体是针对BSA的抗体，说明PCM偶联到了BSA上，并能刺激机体产生抗体。用PCM作为抑制剂测定血清的敏感性时，低浓度的PCM不能阻止血清与包被在酶标板上的PCM-OVA反应，而PCM-OVA溶液却能够有效地阻止血清与包被在酶标板上的PCMOVA的结合，说明在制备PCM的人工抗原时，其抗原决定簇可能被破坏，因此PCM-BSA免疫小鼠的血清在用PCM-OVA包被的酶标板检测时显示有血清效价，但对PCM并没有敏感性，而对结构发生改变的PCM有敏感性。我们在以往的研究中发现，利用玉米赤霉醇制备的人工抗原免疫动物时没有得到能够识别玉米赤霉醇的抗体，但利用其结构类似物玉米赤霉酮制备人工抗原免疫动物得到了能够识别玉米赤霉醇的高灵敏度抗体[27]。因此，可以尝试采用PCM结构类似物制备的人工抗原免疫动物，从而制备能够识别PCM的抗体。

4 结论

本研究尝试通过琥珀酸改造PCM，并采用碳二亚胺法制备PCM人工抗原。用制备的PCM人工抗原免疫小鼠，尽管免疫小鼠的血清效价比较高，但血清对PCM的灵敏度比较低。可能是制备PCM人工抗原过程中，PCM抗原决定簇被破坏。说明本研究采用的制备PCM人工抗原的方法不可行，需要进一步探索新的PCM人工抗原制备方法。可以尝试采用PCM的结构类似物来制备人工抗原，通过免疫动物，来制备针对PCM的抗体。