HPLC 法测定银菊止痒洗液中4 种化学成分的含量＊

谢 巍，杨 妮，肖 萍，卢森华，莫礼艳

银菊止痒洗液由金银花、野菊花、千里光、白鲜皮、苦参、蛇床子、地肤子七味中药组成，是笔者医院在多年临床经验的基础上，辨证施治总结出的有效方剂。具有清热解毒、燥湿止痒之效，用于小儿湿热内蕴，腠理失和所致湿疹。其中，金银花宣散风热，清解血毒；野菊花疏散风热，清肝明目，解毒；蛇床子燥湿，祛风，杀虫的功效［1］；金银花、野菊花、蛇床子主要化学成分有绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-5］。据相关文献报道，绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有较强的抗真菌、细菌、抗炎、抗病毒、抗心肌纤维化等作用［6-12］，提示其可能为银菊止痒洗液所具功效的活性成分。国内外有学者对上述化学成分进行了含量测定［13-18］，对控制银菊止痒洗液的质量有很好的指导意义。然而，中药制剂的成分复杂多样，银菊止痒洗液在处方组成上与其他中药制剂处方有很大差别，在控制其质量标准上不可简单套用其他研究的检测条件，通过测定银菊止痒洗液中四种化学成分的含量，可以更好地控制和评价银菊止痒洗液的内在质量。该研究建立了HPLC同时测定银菊止痒洗液中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素四种化学成分含量的方法，为建立全面合理的银菊止痒洗液控制和评价标准奠定了基础。

1 仪器与试药

U3000 高效液相色谱仪（美国Thermo Fisher公司），HH-S6 数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），Synergy 超纯水机（美国Millipore 公司），KQ-500GDV 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司），XS-205Du 型电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司），高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）。

银菊洗剂来源于柳州市妇幼保健院，由野菊花、金银花、蛇床子、地肤子、千里光、苦参、白鲜皮组成。对照品绿原酸（批号：110753-201716，纯度：99.3%）、咖啡酸（批号：110885-200102，纯度：100.0%）、蒙花苷（批号：111528-201308，纯度：95.1%）、蛇床子素（批号：110822-201308，纯度：100.0%）均为中国食品药品检定研究院标准物质和标准化管理中心提供。

水为超纯水，甲醇、乙腈（美国Fisher 公司，色谱纯），其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备精密称取绿原酸9.8 mg、咖啡酸10.5 mg、蒙花苷9.7 mg、蛇床子素10.9 mg，分别置于10 ml 容量瓶中，加甲醇超声5 min（功率：500 W，频率：40 kHz）使溶解，并用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得各自单一对照品溶液。再分别精密量取上述单一对照品溶液各2.0 ml，置同一10 ml 量瓶中，用甲醇定容，摇匀，制成每1 ml 分别含绿原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的混合对照品溶液。

2.2 供试品溶液的制备精密量取银菊止痒洗液20.0 ml 于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇饱和的水洗涤两次，每次25 ml，弃去洗液，正丁醇萃取液水浴蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至5 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，滤过，取续滤液过0.45 微孔滤膜，即得。

2.3 色谱条件采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，30%A；10～30 min，30%A→50%A；30～35 min，50%A→70%A；35～40 min，70%A；40～41 min，70%～90%A；41～45 min，90%A；45～46 min，90%A→30%A；46～50 min，30%A），流速为1.0 ml/min，检测波长为330 nm，柱温为25 ℃，进样量为5 μl。采用外标法计算含量，理论塔板数以绿原酸计算应不低于5000，分离度大于1.5。

2.4 线性关系考察精密吸取“2.1”项单一对照品溶液各5 ml，置于25 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成每1 ml 分别含绿原酸0.196 mg、咖啡酸0.210 mg、蒙花苷0.194 mg、蛇床子素0.218 mg 的母液，从母液中分别精密量取0.5、1、2、3、5 和10 ml，分别置于10 ml 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，摇匀，分别进样20 μl，以测得的相应信号（峰面积）对被测物质的量作图，得到绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的回归方程分别为：

Y=12.285X+0.1825 r=0.999 0

Y=11.566X+0.1853 r=0.999 0

Y=10.864X+0.0183 r=0.999 0

Y=11.937X+0.0174 r=0.999 0

线性范围分别为1.96～39.2 μg、2.1～42.0 μg、1.94～38.8 μg、2.18～43.6 μg，X 表示样品浓度，Y 表示该浓度下的峰面积。

2.5 精密度试验精密量取银菊止痒洗液20.0 ml于分液漏斗中，按“2.2 供试品溶液制备方法”制备，进样5 μl，连续测定6 次，记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面积的RSD 分别为1.5%、0.05%、0.08%、0.25%；再取同一份银菊止痒洗液供试品溶液，分别于溶液制备后1、2、3、4、5、6 d 同法进样，记录峰面积。结果绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面积的RSD 分别为0.45%、0.58%、0.69%、0.27%，结果表明仪器在日内和日间精密度良好。

2.6 稳定性试验取同一份银菊止痒洗液供试品溶液，分别于溶液制备后0 h、2 h、4 h、12 h、24 h 进样，测定，记录各成分峰面积的RSD。结果绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素峰面积的RSD 分别为0.07%、0.56%、1.16%、2.07%（n=5），表明24 h 内供试品溶液稳定性良好。

图1 混合对照品（A）和银菊止痒洗液（B）HPLC 色谱图

2.7 重复性试验取同一批银菊止痒洗液6 份，每份约20.0 ml，精密称定，按“2.2 供试品制备方法”制备，分别进样5 μl，记录峰面积，并计算含量。绿原酸的平均含量为0.9625 mg/ml，RSD 为1.61%；咖啡酸0.5862 mg/ml，RSD 为0.63%；蒙花苷0.7153 mg/ml，RSD 为1.41%；蛇床子素0.5631 mg/ml，RSD 为1.93%，表明该方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验精密称定已测定含量（每1 ml中含绿原酸0.9572 mg；1 g 中含咖啡酸0.5560 mg；含蒙花苷0.7064 mg；含蛇床子素0.5436 mg），精密量取银菊止痒洗液6 份，每份10 ml，另精密称取对照品绿原酸47.86 mg、咖啡酸27.80 mg、蒙花苷35.32 mg、蛇床子素27.18 mg，置于100 ml 量瓶中，加适量甲醇超声使溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液。分别在上述6 份药材中精密加入混合对照品储备液10 ml，按“2.2 供试品制备方法”制备，分别进样5 μl，记录绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面积，计算含量，并计算回收率，结果见表1。

表1 银菊止痒洗液中4 种化学成分的回收率试验数据（n=6）

2.9 样品含量测定精密量取6 批不同批号的银菊止痒洗液，每份约20 ml，按“2.2”项方法制备供试品溶液，分别进样5 μl 测定，记录绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素的峰面积，并计算含量，结果见表2。

表2 银菊止痒洗液中4 种化学成分的含量测定结果（mg/ml，n=4）

3 讨论

3.1 供试品溶液制备方法的选择该研究优选了不同提取条件制备供试品溶液，采用单因素变量法，考察了不同萃取溶剂（乙酸乙酯、正丁醇和乙醚溶液）、萃取用量（20、25、30 ml）、萃取次数（1、2、3、4 次）、除杂溶剂（乙醚、石油醚，正丁醇饱和水）对银菊止痒洗液中四个化学成分提取率的影响。结果表明银菊止痒洗液用水饱和正丁醇萃取3 次，每次25 ml，合并萃取液，再用正丁醇饱和的水洗涤2 次，每次25 ml，弃去洗液，四种目标成分提取效率明显，且与其余成分分离明显，可用于测定四个有效成分含量。

3.2 色谱条件的选择绿原酸与蛇床子素极性相差较大，以乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）为流动相梯度洗脱［19］、乙腈-水（65∶35）［20］发现蒙花苷和蛇床子素色谱峰的保留时间较长，且基线不平整。随后改用甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液梯度洗脱，各成分出峰时间比较适中，且峰分离度较好，因此选择甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液作流动相，进行梯度洗脱。

3.3 含量测定结果差异银菊洗剂由野菊花、金银花、蛇床子、地肤子、千里光、苦参、白鲜皮组成，分别由不同批号的中药饮片组成，中药饮片由于产地、种植等原因，其有效成分含量均有差异，导致不同批次的银菊止痒洗剂中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素有所差异。

该实验建立了HPLC 同时测定银菊止痒洗液药材中化学成分绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素含量的方法，并测定了6 批不同批次银菊止痒洗液药材中绿原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素4 种化学成分的含量。建立含量的方法，操作简便，分离度高，重复性好，结果准确，可作为银菊止痒洗液含量测定方法，但是：不同批次银菊止痒洗液药材中四个化学成分的含量有一定差异性。提示采用多指标定量方法，能更好地控制银菊止痒洗液药材的内在指标。