云南省野猪源猪瘟病毒E2 及5'NTR基因序列测定分析

赵焕云，张海楠，鲁富有，解明华，曾邦权，陈云明，吕 嵘，李锡慧，张文东

（1.云南省动物疫病预防控制中心，云南昆明 650000；2.普洱市动物疫病预防控制中心，云南普洱 665000；3.宁洱县动物疫病预防控制中心，云南宁洱 665199；4.临沧市动物疫病预防控制中心，云南临沧 677000；5.玉溪市动物疫病预防控制中心，云南玉溪 653100）

猪瘟（classical swine fever，CSF）是由猪瘟病毒（classical swine fever virus，CSFV）感染猪引起的一种临床上以沉郁、多器官出血、高热、高死亡率为特征的高度接触性传染病，是危害养猪业的重要传染病之一，被世界动物卫生组织（OIE）列入须通报动物疫病名录[1-2]，也是我国农业农村部认定的一类动物疫病，是《国家中长期动物疫病防治规划（2012—2020 年）》中明确的优先防治病种[3-6]。

CSFV 属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），其基因组为12 kb 左右的单股正链RNA，含有1 个大的开放阅读框（open reading frame，ORF）。ORF 编码的大蛋白在病毒与宿主蛋白酶作用下形成4 个结构蛋白（C、Ems、E1 和E2）和8 个非结构蛋白（Npro、P7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A 和NS5B）[7]。CSFV 只 有1个血清型，依据E2基因分为3 个基因型（1～3）、11 个亚型（1.1～1.4、2.1～2.3、3.1～3.4），其中2.1亚型又可进一步分为2.1a、2.1b、2.1c 和2.1d 共4个分支[8-10]。野猪是CSFV 的自然贮存宿主。我国野猪资源丰富，但仅有少量野猪感染CSFV 的报道[11-12]，更未见到关于野猪源CSFV 的分子流行病学报道。

本研究对近期从云南省宁洱县同心镇山林中2 头死亡野猪分离到的2 株CSFV 毒株（YNPEwildboar3180919、YNPEwildboar4180919）进行了E2及5'NTR 基因序列测定分析，以了解云南省野猪体内CSFV 的基因变异情况，从而为云南省CSF 防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品

2 份猪脾、肺组织样品，分别来自宁洱县2 头病死野猪，低温运输到实验室。

1.2 质粒与菌种

TaKaRa pMD18-T 载体，购自宝生物工程（大连）有限公司；DH5α 大肠埃希氏菌，本实验室保存。

1.3 主要试剂

一步法RT-PCR 试剂盒（TaKaRa One Step RNA PCR Kit/AMV）、PCR 扩增试剂盒（TaKaRa PCR Amplification kit）、PCR 产物胶回收试剂盒、质粒（小量）抽提试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司；全自动核酸提取试剂盒，购自西安天隆公司。

1.4 引物设计与合成

参考Alexander 等[13]的E2和5'NTR 基因序列设计引物，由宝生物工程（大连）有限公司合成。收到引物后用DEPC 水稀释至20 pmol/μL，-20 °C保存备用。

1.5 核酸提取

按照自动核酸提取试剂盒操作说明书，从研磨好的病料组织上清液中提取病毒基因组RNA，-80 ℃保存备用。

1.6 E2 和5'NTR 基因RT-PCR 扩增

采用TaKaRa One Step RNA PCR Kit（AMV）试剂盒，以提取的总RNA 为模板，经RT-PCR 对E2和5'NTR 基因片段进行扩增。按照试剂盒提供的操作手册配制反应体系，进行反应条件筛选和优化。反应条件：50 °C，30 min；94 °C，2 min；（95 °C，15 s；45～55 °C，15～30 s；72 °C，30～45 s）×35；72 °C，7 min；4 °C 或-20 °C保存。取5 μL 进行电泳分析，预期E2基因产物大小约1 500 bp，5'NTR 基因产物大小约270 bp。

1.7 PCR 产物纯化、克隆及测序

按照试剂盒操作手册，对RT-PCR 扩增产物进行凝胶切割纯化，经电泳定量后，稀释至50 ng/μL。取1 μL 纯化产物与1 μL pMD18-T 载体（50 ng/μL），按操作手册进行连接反应，连接产物转化DH5α 感受态细胞，37 ℃孵育30 min 后，涂布于0.1 mg/mL Ampcilin 抗性平板，37 ℃过夜培养；采用质粒引物及目的基因上下游引物，对单个菌落进行PCR鉴定；阳性菌落接种5 mL 含Ampcilin 的LB 培养液中增殖培养后，采用试剂盒提取质粒，电泳分析确认后，送宝生物（大连）有限公司测序。

1.8 序列比对分析

采用DNAMAN、MEGA6.0 等分子生物学软件，将测得的2 个毒株基因序列与参考毒株序列进行同源性及系统发育分析。比对分析中引用的参考毒株信息见表1。

表1 序列比对分析中引用的国内外CSFV 参考毒株信息

2 结果

2.1 E2 及5'NTR 基因序列比对

2.1.1E2基因使用MEGA6.0 软件，将2 株野猪源CSFV 毒株E2基因与国内外已发表的代表毒株进行序列比对及系统发育分析。结果显示：2 株野猪源CSFV 同源性为87.2%，与国内外参考毒株同源性分别为81.2%～94.6%（YNPEwildboar3180919）、81.0～97.6%（YNPEwildboar4180919），与我国2012 年河南毒株（CSFVHNYY2012）、2001 年台湾毒株（CSFVTWN040601）同源关系比较近，同源性分别为88.3%～94.6%（YNPEwildboar3180919）、89.8%～97.6%（YNPEwildboar4180919）；与我国强毒株Shimen 株（CSFVShimenHVRI）同源性较低，同源性分别为82.0%（YNPEwildboar3180919）、81.2%（YNPEwildboar4180919）。系统发 育 分析结果（图1）显示：所测的2 株野猪源毒株均属于基因2.1 亚型。氨基酸序列分析结果（表2）显示：YNPEwildboar3180919 分离毒株与我国2.1d 亚型CSFV 蛋白相比，有6 个相同的突变特征（R31、S34、W182、K205、K303、A331）；而YNPEwildboar4180919 毒株前4 个氨基酸与YNPEwildboar3180919 相同，但在R303、V331这2 个氨基酸上具有2.1b 亚型毒株特征，其可能是2.1b 向2.1d 亚型演化的中间毒株，这与2020 年许浒等[14]的研究结果一致。

表2 CSFV E2 基因编码氨基酸变异位点比对分析结果

图1 CSFV E2 基因系统发育分析结果

2.1.2 5'NTR 基因 将测得的2 株野猪源CSFV毒株5'NTR 基因与国内外已发表的毒株序列进行比对，发现两毒株间的同源性为100%，与国内外参考毒株的同源性为93.6%～98.5%，其中与中国强毒株Shimen 株（CSFVShimenHVRI）同源性为95.6%，与Brescia 株（CSFVBRESCIAX2001）同源性为96.3%，与我国2006 年陕西毒株（CSFVSXYL2006）、2001 年台湾毒株（CSFVTWN040601）同源关系较近，同源性分别为97.8%、98.5%。系统发育分析结果（图2）显示，该2 株CSFV 毒株5'NTR 基因均属于2.3 亚型。

图2 CSFV 5'NTR 基因系统发育分析结果

3 讨论

CSF 作为严重威胁养猪业的主要疫病之一，历来备受关注。自20 世纪50 年代CSFV 兔化弱毒疫苗在我国被广泛使用后，CSF 得到了有效控制。但随着2017 年CSF、高致病性猪繁殖与呼吸综合征退出强制免疫，CSF 在云南省多地时有发生，对养猪业造成了不同程度的经济损失。

本研究所测2 个毒株E2基因属于2.1 亚型，与Shimen 株同源性只有81.2%～82.0%，可见CSFV 的E2基因从分子程度上在向远离Shimen 株方向发展，其中一株具有2.1d 亚型变异特征，另一株与2.1d 亚型略有差异，介于2.1b 与2.1d 亚型分支之间，可能是2.1b向2.1d亚型演化的中间毒株。Van Rijn 等[15]研究发现，E2 蛋白的氨基酸序列中含有15 个较为保守的半胱氨酸（Cys）残基，其中位于E2 蛋白N 末端的6 个Cys 残基（4、48、103、120、139、167 位氨基酸处），对E2 蛋白特异性抗原决定簇的形成及其结构的正确折叠起着重要作用。本研究中的2 个CSFV 毒株序列在这些位点上均未发生变异，与许浒等[14]近年的研究结果相同，说明所测毒株与我国近年来流行毒株一样，虽存在一定的遗传衍化，但总体比较稳定。所测毒株5'NTR 基因属于2.3 亚型，与Shimen 株的同源性高达95%以上，所测毒株是否是由不同毒株重组而来的，这有待于进一步研究确定。此次研究未将云南省野猪源毒株与家猪源病毒株进行比较，有待后续进一步研究探索。

野猪源CSFV 基因序列及系统发育分析在国外文献中多有报道[16]，但在我国尚少见。本研究尽管受试验条件、样品数量等的限制，未能进一步研究基因变异与病毒致病性关系等问题，但也为CSF 防控提供了分子流行病学依据，为进一步做好分子变异等研究奠定了基础。