4种野生百合对盐碱胁迫生理响应的初步研究

张 婷 徐 捷 李名扬 刘道凤 石凌铭 陈 铁

（西南大学园艺园林学院，重庆 400715）

百合（Lilium brownii）是多年生鳞茎植物，其花色艳丽，是重要的观赏花类[1]，适宜在微酸性土壤中生长，是对盐碱比较敏感的一类植物。土壤盐碱度是关系到百合能否正常生长的重要因素，而中国土壤的盐化和碱化常常同时发生，成分复杂且程度各不相同[2]。土壤盐分引起植物的渗透胁迫和毒性胁迫，导致生长抑制、发育变化、代谢适应和离子隔离或排斥[3]。

盐碱逆境的研究在当今农业生产制约因素中是热点问题之一，许多研究表明，盐碱胁迫不是单一的盐、碱2种胁迫的叠加，植物不仅仅会受到盐胁迫产生的渗透伤害和离子伤害，还受碱胁迫引起的高pH影响，为2种胁迫的协同效应[4]。左志锐[5]研究了东方系百合‘Sorbonne’和亚洲系‘Prato’在不同浓度盐胁迫和不同生长发育阶段下形态指标和生理生化指标的变化，结果表明‘Prato’在耐盐能力方面较‘Sorbonne’强。高胡静[6]在同一盐浓度下对百合不同品种或种的组培苗进行胁迫根据综合评价，按耐盐性强弱排序为‘耀眼黄’>‘伯尼尼’>‘真情’>‘元帅’>‘辛普隆’>云南野生百合>麝香百合>‘西伯利亚’。刘卫卫等[7]用不同浓度的NaCl处理百合外植体，发现百合对盐胁迫特别敏感，随着盐浓度的增加，百合不定芽的脯氨酸（Pro）和丙二醛（MDA）含量均不断升高。周叶玲等[8]以采自秦巴山区的5种野生百合为试验材料，‘Prato’为对照，通过不同盐浓度处理，在组织培养条件下对各野生百合材料的耐盐性进行了初步评价，得出耐盐性强弱排序为‘Prato’>宜昌百合>野百合>山丹百合>宝兴百合。综上所述，关于百合的耐盐碱性研究一般都集中于单一盐性物质的耐盐机理方面，进行耐盐性的差异排序，且已有一定的研究基础，但在百合耐复合盐碱的差异研究，在国内外都少见报道。

野生百合资源在我国分布较广，部分具有较高观赏价值和较强抗性，西南和东北地区是我国野生百合集中分布区域之一，其中西南地区最为集中。此区域的野生百合中，宜昌百合是我国的特有野生种，其花清香怡人，具有极高的观赏价值，抗病能力强，是百合优良亲本材料[9]。通江百合强健耐寒、花大芳香，甚是美丽[10]。淡黄花百合植株健壮、花型奇特，耐阴、耐热性强，是育种的优质种源[11]。毛百合花朵直立，向上开放，是培育直立花品种的重要亲本材料[12]。目前，对这4种百合的研究多集中在资源调查、繁殖技术、栽培等方面，尚未发现有学者进行耐盐碱性研究。本研究通过对4种野生百合盐碱胁迫下多项生理指标的测定、分析和评价，综合各项指标及采用隶属函数分析4种野生百合耐盐碱性强弱，探讨百合耐盐碱的生理机制，为选育优良亲本体系，培育出新品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

以通江百合（Lilium sargentiae）、毛百合（Lilium dauricum）、淡黄花百合（Lilium sulphureum）、宜昌百合（Lilium leucanthum）4种野生百合为研究对象，采用鳞茎扦插法，选取长势基本一致的扦插苗作为实验材料。于2019年11月上旬将百合扦插苗移栽于外口径12 cm，高10.8 cm的塑料花盆中，盆土为草炭和珍珠岩按体积比为1∶1混合配制，并在盆底部和表层放入1层陶粒，每盆基质量保持一致。实验于西南大学33教7楼温室进行，温室温度保持在22～25 ℃，进行正常养护管理，度过缓苗期。

1.2 实验方法

1.2.1 盐碱复合处理

于2019年11月19日，对每种百合随机选取25～30株生长健康，叶片数近似的植株进行胁迫处理。共设置5个处理梯度，分别为0（CK）、40、80、120、160 mmol/L，每个实验组3个生物学重复，每组处理5～6盆。CK浇Hogland营养液，处理组浇营养液+混合盐碱（以中性盐NaCl和碱性盐NaHCO3按照摩尔比例1∶1混合）[4]，为避免盐冲击效应，处理浓度按照40 mmol/L每天递增，直至最大设计浓度后，开始计算胁迫时间。此后每隔5d的9：00—10：00定期按各处理浓度浇混合液，进行2次后，于胁迫的第11天拍照采样。

1.2.2 形态表现观察

参照肖涵等[13]对植物形态评价体系（表1），以植株和叶片形态以及色泽方面为依据，划分盐碱胁迫对百合苗影响的程度，以便观察。

表1 植物生长状况等级评价Table 1 The grade evaluation of plant growth condition

1.2.3 生理指标测定

于12月2日9：00—11：00采用，使用分析天平秤（精确到0.01 mg）称取0.5 g叶片样本，除必须现用叶片外，其余使用锡箔纸包好后及时放入液氮中，待样本取完后放入−80 ℃冰箱保存，以便使用。使用DDS−309+电导率仪（成都市方舟科技开发公司，中国）测定相对电导率（REC）；叶绿素含量采用丙酮浸提法测定；MDA含量采用硫代巴比妥酸法测定；Pro含量采用酸性茚三酮法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑光还原法测定；可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。具体操作均参考李合生[14]实验方法。

1.3 数据处理

采用隶属函数法对4种百合的耐盐碱性进行综合评价[15]，如果指标与耐盐碱性成正相关，则按公式（1）计算，如果指标与耐盐碱性成负相关则按公式（2）计算。使用Microsoft Excel2013制表和作图，利用SPSS22.0进行标准差分析和显著性分析。

式中：X(i)为隶属函数值，X为某一指标平均测定值，Xmax、Xmin分别为参试材料某一指标测定值内的最小值和最大值。

2 结果与分析

2.1 盐碱胁迫对4种百合形态的影响

通江百合和淡黄花百合形态受盐碱胁迫影响程度小于毛百合和宜昌百合，宜昌百合受影响程度最重。盐碱胁迫对植物生长状况评价结果见表2。

信贷扶贫资金管理方面主要的创新有：第一，借款主体的创新，先后尝试了直接贷款到户、扶持经济实体、支持地方主导产业和龙头企业，以及直接贷款到户与委托帮扶贷款相结合等方式；第二，贷款方式创新，1986年以来尝试了政府信用下的经济实体贷款、依托社会信用的小额贷款、抵押和担保为基础的企业或政府贷款等；第三，贴息方式创新，尝试了贴息给承贷银行、贴息给借款人等方式；第四，承贷机构选择，先后尝试了商业银行承贷、政策银行承贷、地方政府选择等方式。

表2 盐碱胁迫对植物生长状况等级结果Table 2 The evaluation result of plant growth on saline-alkali stress

由表2可知，盐碱胁迫浓度在40 mmol/L，通江百合和淡黄花百合生长较旺盛，叶质鲜亮、饱满，和未受胁迫时的生长状况相近；毛百合和宜昌百合生长良好，叶片较饱满、略微变淡。胁迫浓度在80 mmol/L，宜昌百合较正常，未出现大面积萎蔫，仅叶色变淡、皱缩，其他3种百合均生长良好，叶片略微变淡、叶质较饱满。胁迫浓度在120 mmol/L，通江百合和淡黄花百合保持正常生长的状态，有叶片皱缩、叶片变淡的现象，毛百合和宜昌百合则生长受到了抑制，出现萎蔫皱缩，叶片萎蔫下垂、暗淡失绿的趋势。胁迫浓度在160 mmol/L，宜昌百合生长受到了严重抑制，出现萎蔫失水，叶片皱缩严重、失绿变黄，其余3种百合生长也受到了一定程度的抑制，出现非常明显的叶质萎蔫，叶片失绿。

2.2 盐碱胁迫对4种百合生理生化指标的影响

2.2.1 盐碱复合胁迫对光合色素的影响

由图1可知，随着盐碱胁迫浓度的增大，4种百合的叶绿素含量均呈下降趋势，除通江百合外，其他3种百合的类胡萝卜素含量均有增有降。

图1 盐碱胁迫对4种百合叶绿素和类胡萝卜素含量的影响Fig. 1 Effects of saline-alkali stress on chlorophyll and carotenoid contents of 4 lily species

当胁迫浓度为160 mmol/L，4种百合的叶绿素含量降幅较CK均达到最大，其中，毛百合的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素含量的降幅最大，分别为47.83%、59.06%、52.29%；而宜昌百合的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素含量的降幅最小，分别为23.35%、19.92%、21.61%；通江百合的类胡萝卜素含量降幅最大，为58.43%。当胁迫为40 mmol/L时，毛百合与通江百合、淡黄花百合的叶绿素含量差异显著（P<0.05）；盐碱胁迫160 mmol/L时，通江百合与其他3种百合的叶绿素a和叶绿素含量差异显著（P<0.05）。

2.2.2 盐碱胁迫对渗透调节物质含量的影响

盐碱胁迫对4种百合渗透调节物质的影响见表3，盐碱胁迫下4种百合渗透调节物质含量相对变化量见表4。

表4 盐碱复合胁迫对4种百合质膜稳定性的影响Table 4 Effects of saline-alkali stress on membrance permeability of 4 lily species

由表3、图2可知，宜昌百合可溶性蛋白含量随着盐碱胁迫浓度增加呈现持续上升的趋势，而其他3种百合均先升高后降低，且幅度均不明显。通江百合在胁迫浓度80 mmol/L处到达峰值，为CK的1.07倍；毛百合和淡黄花百合峰值出现在胁迫浓度120 mmol/L，分别为CK的1.18倍、1.06倍；宜昌百合的峰值在胁迫浓度160 mmol/L，为CK的1.15倍。在CK中，毛百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）；胁迫浓度为160 mmol/L，宜昌百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）。

图2 盐碱胁迫下4种百合渗透调节物质含量相对变化量Fig. 2 The relative variation of osmotic adjustment substance of 4 lily species under saline-alkali stress

表3 盐碱胁迫对4种百合渗透调节物质的影响Table 3 Effects of saline-alkali stress on osmotic adjustment substance of 4 lily species

随着盐碱胁迫浓度不断增加，通江百合、毛变百合、宜昌百合的可溶性糖含量变化趋势均是先增后减，且含量峰值均出现在80 mmol/L时，3种百合可溶性糖含量上升的总幅度最大的是毛百合，为223.89%，其次是通江百合和宜昌百合，分别为115.30%、106.79%。淡黄花百合的可溶性糖含量则小幅持续上升，胁迫浓度为160 mmol/L，较CK增加了42.53%。当胁迫浓度在40、160 mmol/L时，淡黄花百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）；在其余2种浓度下，毛百合与宜昌百合、淡黄花百合差异显著（P<0.05）。

4种百合的Pro含量随盐碱胁迫浓度增加呈升高趋势，但幅度和增长动态有所不同。通江百合和淡黄花百合上升速度较缓慢；宜昌百合在4种百合中Pro含量积累最多，在胁迫浓度120 mmol/L后，增幅较大，在胁迫浓度为160 mmol/L时的Pro含量为CK的129.96%；其次是毛百合，为85.97%，。CK组通江百合Pro含量高于其他3种，淡黄花百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）；其余胁迫浓度下，宜昌百合与毛百合、淡黄花百合差异显著（P<0.05）。

2.2.3 盐碱胁迫对质膜稳定性的影响

结合表4和图3可知，随着盐碱胁迫浓度的增加，4种百合REC均呈缓慢上升趋势，种间增幅差异不明显，当胁迫到最高浓度160 mmol/L时，4种百合REC分别是CK的1.41倍、1.49倍、1.35倍、1.46倍。淡黄花百合的REC在胁迫前后均高于其他3种百合，胁迫浓度在120 mmol/L之前，淡黄花百合与其他3种百合差异显著（P<0.05），当胁迫浓度达到160 mmol/L时，宜昌百合与毛百合、通江百合差异显著（P<0.05）。

图3 盐碱胁迫下4种百合质膜调节物质相对变化量Fig. 3 The relative variation of plasma membrane regulators of 4 lily species under saline-alkali stress

4种百合随着盐碱胁迫浓度的增加MDA含量均先增后减，且变化量差异较明显。4种百合与CK增量的峰值均出现在胁迫浓度80 mmol/L，MDA含量上升的总幅度最大是淡黄花百合，为125.32%；其次是宜昌百合、毛百合，分别为80.85%、68.41%；最小的是通江百合，为39.94%。4种百合中，淡黄花百合的MDA含量在受到盐碱胁迫后均高于其他3种。CK中毛百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）；受胁迫后，淡黄花百合与宜昌百合、通江百合差异显著（P<0.05）。

2.2.4 盐碱胁迫对活性氧代谢的影响

盐碱胁迫对4种百合SOD活性的影响见表5，盐碱胁迫下4种百合SOD活性相对变化量见图4。结合表5和图4可知，随着盐碱胁迫浓度的增加4种百合的S0D活性均先升高后降低，至胁迫浓度80 mmol/L时SOD活性达最大值，说明SOD活性随着盐碱胁迫程度的增加受到了抑制。

图4 盐碱胁迫下4种百合SOD活性相对变化量Fig. 4 The relative variation of superoxide dismutase activity of 4 lily species under saline-alkali stress

表 5 盐碱胁迫对4种百合SOD活性的影响Table 5 Effects of saline-alkali stress on superoxide dismutase activity of 4 lily species

胁迫浓度160 mmol/L，通江百合、宜昌百合分别比CK下降36.30%、19.38%；胁迫浓度80 mmol/L，毛百合、淡黄花百合分别比CK增加11.03%、19.07%。CK组4种百合中，通江百合与其他3种百合差异显著（P<0.05）；胁迫浓度至120 mmol/L之后，毛百合与淡黄花百合差异显著（P<0.05）。

2.3 盐碱耐性综合评价

以4种百合各项生理指标的平均隶属函数值作为百合耐盐碱性的综合评价标准，数值越大说明其耐盐碱性越强。由表6可知，4种百合耐盐碱性能力从大到小为淡黄花百合>通江百合>毛百合>宜昌百合。

表6 种百合耐盐碱性生理指标平均隶属函数值Table 6 Average subordinate function on saline-alkali resistance index of 4 lily species

3 结论与讨论

植物在生长过程中往往会遭受到各种逆境的伤害，而植物的盐碱耐性研究一直是逆境研究中的一个重要研究方向。在盐碱浓度过高的条件下会导致细胞受伤害或死亡，往往有通过一些外观形态体现，经形态评价表等级评定得出。在本研究中，当胁迫浓度达到160 mmol/L，宜昌百合生长受到严重抑制，叶片黄化、萎蔫下垂，枯叶较多，其他3种百合受抑制程度小于宜昌百合，呈现叶片失绿变淡，表明其耐盐碱性强于宜昌百合。通江百合与淡黄花百合在受到低浓度盐碱胁迫时，其外观形态表现较对照无明显差别，这也体现植物外部形态变化相对于生理变化会相对滞后[16]。

叶绿素是一种重要的光合色素，植物光吸收中起核心作用。其含量的高低能一定程度上衡量植株的抗逆性[17]。类胡萝卜素不仅直接参与光吸收也能防止前体细胞发生光氧化，保护叶绿素免受破坏。在研究中，4种百合的叶绿素含量呈下降趋势，说明盐碱胁迫抑制了叶绿素的合成，其光合产量减少，这与魏祎等[18]关于东方系百合‘ 罗迪纳’的研究相一致。除通江百合外的3种百合的类胡萝卜素含量略有增减，可能与类胡萝卜素可以作为植物体内的内源抗氧化剂有关，白文波等[19]指出在短期盐碱胁迫下，一些植物的类胡萝卜素反而上升的推论。可见，盐碱胁迫下类胡萝卜素含量变化因植物不同而异。

植物的渗透调节物质主要分为两大类，无机渗透调节物质和有机渗透调节物质等[20]。Pro、可溶性糖、可溶性蛋白是百合体内重要的有机渗透调节物质，在盐碱胁迫条件下百合可以通过大量累积Pro和可溶性糖来加强渗透调节，缓解盐害，表现出含量增加，直至细胞膜受损严重，达到细胞耐盐碱阈值后开始下降。本研究结果显示，随盐碱胁迫浓度的增大，首先快速积累的渗透调节物质是可溶性糖，说明百合可通过积累糖类物质来抵抗盐碱胁迫，当胁迫浓度超过80 mmol/L后，通江百合、毛百合、宜昌百合可溶性糖的含量开始逐渐下降，说明百合的渗透物质代谢系统受到破坏，可能是盐碱胁迫后期高pH影响，对百合的渗透代谢系统造成了损害，与刘铎等[21]的研究中类似。而3种百合的Pro含量开始快速积累，表明Pro原是胁迫程度的产物，而不是渗透胁迫的产物。这可能是百合对盐碱胁迫有一定的耐受性，当超过耐受范围时大量积累Pro，以此缓解盐碱胁迫带来的伤害，直至承受不住高盐碱胁迫作用而失效，在垂丝海棠（Malus halliana）[4]的耐盐碱性试验中也有相似的结果。研究结果一致。可溶性蛋白在植物体内主要包括一些代谢过程的酶类和渗透调节蛋白等物质，维持着细胞内较低渗透压[22]。通江百合、毛百合、淡黄花百合在盐碱胁迫后体内的可溶性蛋白含量先上升后下降，这与刘凤岐等[23]在对4种燕麦（Avena sativa）的耐盐性评价中结果类似。但4种百合的可溶性蛋白含量变化不明显，且有出现下降趋势的原因究竟是代谢出现异常，合成受到阻碍，还是在机制调节过程中可溶蛋白被降解，还需要做深入研究。由此推测出可溶性蛋白对百合渗透压的调节不起主要作用。

另外，Pro是一种理想的渗透调节物质；Pro和其他一些可溶性物质的累积可以降低细胞的水势,进而驱使水分进入细胞或降低水分从细胞中流出，帮助细胞抵抗盐碱胁迫，是植物抵抗高盐环境的重要物质[24]。4种百合的Pro含量均表现为不断增加，说明百合的耐盐碱性与体内Pro的积累有一定关系，这与于爽等[25]对龙葵（Solanum nigrum）和董静等[26]对马齿苋（Portula caoleracea）的盐碱胁迫研究结果相一致。

植物受到盐离子的毒害时，细胞膜系统是主要受害部位，盐碱胁迫会破坏质膜透性，造成细胞膜过氧化，选择性降低或丧失，细胞内的电解质外渗，而使组织浸出液的REC升高[27]。MDA是由于活性氧攻击细胞膜上的膜脂产生的，是反应细胞膜脂过氧化程度的重要指标，可以间接反应细胞的受损程度。本研究表明，4种百合随着盐碱胁迫浓度的增加，REC升高，说明百合的细胞膜透性遭受破坏，大量离子外渗，这与刘晓涵等[28]关于烟草（Nicotiana tabacum）的研究结果相似。MDA含量随盐碱浓度的增加呈现先上升后下降现象，说明百合体内的活性氧随着增加，造成膜质过氧化伤害，这与李莹莹等[29]对猴樟（Cinnamomun bodinieri）幼苗的探究结果一致。在胁迫浓度到达80 mmol/L之后，MDA含量开始下降，这表明百合可能是在一定的胁迫浓度范围内，随着MDA含量积累到一定值后会触发植物体内的清除MDA的酶促机制，相关酶的快速合成导致MDA的分解下降。

SOD是一种极其重要的并且在各种生物体内普遍存在的防止活性氧化物毒害的抗氧化酶，在植物应激反应中发挥了重要的作用，并在整个活性氧清除机制中扮演最重要的角色。因此可以根据保护酶活性的强弱来判断植物抗盐碱能力的强弱[30]。本研究中4种百合的SOD活性以80 mmol/L为峰值先升高后减低，这与刘荣等[31]在研究百合对盐胁迫的生理反应中得出的SOD活性随着盐胁迫时间的延长先升后降的结果相一致。并且在蒙古柳（Salix linearistioularis）[32]和菊花（Dendranthema morifolium）[33]等植物的耐盐性研究结果中，也有相似的变化。通过研究机理发现，百合在低盐碱胁迫浓度下，主要依靠提高SOD的活性来清除活性氧、自由基，从而使百合对盐碱胁迫有一定的耐受能力，当胁迫浓度超过一定值后，植物体的新陈代谢紊乱，致使活性氧清除机制遭到破坏，使其酶活性下降，SOD不足以清除植物体内产生的活性氧、自由基等[34]，导致百合对盐碱伤害的防御力降低。

植物受到盐碱胁迫后其生理机能和结构较为复杂，决定了不能从单项机理研究去准确地评价某一植物的耐盐碱性[35]。在本研究中，随着浓度增加，受胁迫表现逐渐明显。百合的光合作用下降，有机物积累量降低；细胞膜膜脂氧化程度加剧，完整性被破坏；细胞的活性氧清除，酶活性升高；细胞渗透压增大。在盐碱胁迫浓度≤160 mmol/L的情况下，利用隶属函数分析得出耐盐碱性排序为淡黄花百合>通江百合>毛百合>宜昌百合。由此得出淡黄花百合和通江百合对盐碱生境具有较强耐性，为野生百合的耐碱性筛选奠定了基础，以期为更好地利用野生百合资源，提高百合的耐盐碱性提供理论性支持。