黄芩素对痤疮模型大鼠局部组织IL-4、MMP-9的影响❋

刘 婧，朱 鹏，郑 婷，谢 千，郭斐斐，牛凡红，王思农

(甘肃中医药大学，兰州 730000)

痤疮是一种毛囊皮脂腺的炎症性疾病，好发于青少年，其患病率为82.9%，临床表现为面颊部、胸背部的粉刺、炎性丘疹、结节、脓疱，易反复发作，迁延不愈，预后常遗留瘢痕影响患者的生活质量[1，2]。本实验通过外用黄芩素治疗模型大鼠耳廓复合痤疮，对局部组织进行HE染色观察及ELISA法检测组织中IL-4以及MMP-9的含量，以探究黄芩素干预痤疮发生发展的作用机制。该研究经甘肃中医药大学伦理委员会批准，伦理批准编号2018-116。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级雌雄各半的Wistar大鼠64只，体质量(160±20)g，7～9月龄，由甘肃中医药大学科研动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2015-0002。饲养于湿度45%～55%、温度21 ℃～25 ℃的环境中，以标准鼠饲料及无菌水饲养，动物福利按照国际相关实验动物法规实施。

1.2 药物

黄芩素(批号ZY20190927)，由南京源植生物有限公司提供；凡士林(批号Q1402ALX172)，由山东利尔康医疗科技股份有限公司提供；50%油酸溶液(批号H20171201)，由无锡市亚泰联合化工有限公司提供；0.025%维A酸乳膏(批号H37023768)，由山东良福制药有限公司；IL-4ELISA试剂盒(批号MM-0191R1)，由江苏酶免实业有限公司提供；MMP-9ELISA试剂盒(批号MM-20918R1)，由江苏酶免实业有限公司提供。

1.3 主要仪器

电子天平(苏州坤宏电子有限公司，型号BMB124)；超低温保存箱(海尔集团，型号DW-25W518)；酶标仪(上海酶联生物科技有限公司，型号SP-Max2300A2)；高速冷冻离心机(河南北弘仪器有限公司，型号TGL16 M)；电动离心机(常州市光合有限公司，型号LD34)；显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司，BA400Digital)。

1.4 方法

1.4.1 造模方法与分组 将64只雌雄各半的大鼠按随机数字表法抽取10只作为空白组，对剩余54只大鼠用kligman法建立右耳廓复合痤疮模型[3]，即在大鼠右耳内侧面耳导管开口处每日涂50%油酸溶液1次，每次0.5～1 mL，隔日于大鼠耳廓皮内注射痤疮丙酸杆菌菌液，连续3周。左耳不做任何处理，以作对比。待第22天时观察大鼠耳廓皮损形态，右耳造模部位出现红肿，皮温升高，肉眼可见扩张的毛细血管、毛孔增大、脱屑及丘疹样隆起或囊肿，触之皮损处粗糙干燥，并参考痤疮模型判定分级标准[4]，提示复合痤疮模型已形成。随机抽取4只进行病理切片观察，病理提示造模成功后，将剩余50只大鼠随机平均分为模型组、黄芩素高、中、低剂量组以及阳性对照组。

1.4.2 给药治疗 分组完成后开始给予造模处药物治疗，以凡士林为基质将黄芩素混合于其中，根据人与实验动物等效剂量换算得出：黄芩素低剂量组给予0.04 g生药/cm2·d，中剂量组给予0.08 g生药/cm2·d，高剂量组给予0.16 g生药/cm2·d，阳性对照组0.025%维A酸给予5 g/cm2·d，将药物均匀地涂抹于痤疮模型处，范围约1 cm×1 cm，厚度约1 mm，每日给药1次，给药完成后固定于鼠板20 min，连续4周。空白组和模型组均不涂抹任何药物。

1.5 形态学及组织学观察

每日肉眼观察并记录大鼠耳廓造模处用药前后皮损情况，末次用药24 h后，大鼠经3%的戊巴比妥麻醉后剪下一半右耳用HE染色处理，光镜下观察病理学组织形态，采集标本后行颈椎脱臼法处死各组动物。

1.6 细胞因子检测

取剩余的一半右耳进行皮肤组织匀浆细胞因子检测，用预冷PBS溶液将大鼠右耳皮肤中的血液洗净研碎后晾干放于EP管，加PBS匀浆(组织∶PBS体积比为1∶100)，离心后取上清液，用酶联免疫吸附法检测IL-4、MMP-9的含量。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 肉眼观察用药后各组大鼠皮损变化

图1示，空白组耳廓柔软光滑，毛细血管清晰可见，模型组皮损处可见红肿、脱屑及丘疹样隆起或囊肿，毛细血管扩张，触之皮温升高，粗糙干燥。阳性对照组可见轻度红肿，脱屑减轻，皮损部位温度降低，毛细血管及毛孔稍有缩小。高剂量组可见皮损处恢复光滑柔软，毛孔缩小，可见清晰的毛细血管，温度与空白组基本一致，中剂量组与阳性对照组大致一致，皮损处红肿减轻温度降低，脱屑缓解，皮损处柔软，低剂量较模型组改善效果不显著。

注：a.空白组；b.模型组；c.阳性对照组；d.低剂量组；e.中剂量组；f.高剂量组图1 肉眼观察用药后各组大鼠皮损比较

2.2 病理学观察各组大鼠用药后右耳廓皮损变化

图2示，光镜下可见空白组耳廓厚度均一，皮下胶原纤维排列较为致密，毛囊及皮脂腺未见组织学改变，真皮及表皮界限清晰，脂肪组织清晰可见。模型组可见，表皮层增厚，角栓堵塞，毛囊增大，真皮层内皮脂腺增生，皮下间质内形成明显坏死灶，皮下组织内炎性坏死灶形成，中性粒细胞及淋巴细胞浸润。阳性对照组与中剂量表皮层厚度较为均一，角化物减少，炎性细胞及纤维坏死也较模型组减少。高剂量组表皮层较薄，炎性细胞基本消失，纤维组织减少。低剂量组表皮层较增厚，纤维组织增生，伴有中性粒细胞及淋巴细胞浸润。

注：a.空白组；b.模型组；c.阳性对照组；d.低剂量组；e.中剂量组；f.高剂量组图2 各组大鼠耳部组织炎症改变比较(HE×100)

2.3 ELISA法检测痤疮模型大鼠局部组织中IL-4、MMP-9含量

表1示，模型组与空白组比较，IL-4、MMP-9含量显著上升，差异有统计学意义(P<0.05)；黄芩素低、中、高剂量组及阳性对照组大鼠组织中IL-4、MMP-9的含量与模型组比较均有不同程度降低，差异有统计学意义(P<0.05)，各组含量趋势为高剂量组<阳性对照组<中剂量组<低剂量组。

表1 各组痤疮模型大鼠局部组织中IL-4、MMP-9含量比较

3 讨论

现代医学认为，痤疮的发生与皮脂腺功能亢进、毛囊角化过度、雄激素水平异常、痤疮丙酸杆菌感染、炎症相关[5]。特异性免疫反应与痤疮的发生发展联系密切，其中Th2细胞分泌的IL-4在免疫和炎症反应中发挥了重要作用[6]，IL-4与痤疮的严重程度呈正比，且临床研究表明IL-4与患者的痤疮瘢痕有密切联系[7，8]。金属蛋白酶(MMPs)属于锌依赖性内肽酶，存在于细胞外基质中。在痤疮患者的皮损组织中，MMP-2、MMP-3 以及 MMP-9呈现高表达，MMPs的高表达可以加速皮肤胶原纤维的降解，最终导致瘢痕形成[9]。

《素问·生气通天论篇》曰：“劳汗当风，寒薄为皶，郁乃痤。”外邪、痰湿、血热致玄府闭塞，郁火内生，升降悖逆，气液失运，变生痰瘀，渐成结节，触之肿硬疼痛或按之如囊[10]。黄芩性苦、寒，有清热燥湿、安胎止血之效[11]，黄芩素是黄芩的主要成分之一，属于5，6，7-三羟基黄酮，因其化学性质活泼，水溶性较差[12]，故本实验以凡士林为基质。现代药理研究发现，黄芩素可通过抑制iNOS、COX-2、NO、IL-6等因子的释放，从而减轻炎症[13]，或通过抑制髓样分化因子-2(MD-2)/TLR4复合物的形成以及炎症小体的激活，降低促炎介质表达[14]。罗晓平等[15]发现，黄芩素能够干预AKT/NF-κB通路磷酸化蛋白表达而抑制该通路激活，减少炎症因子释放。并可通过内质网应激CHOP/STAT途径抑制细胞因子、趋化因子和生长因子，对双链RNA诱导的巨噬细胞起到抗炎作用[16]。在体外细胞模型实验中发现，黄芩素可通过NF-κB和Wnt/b-catenin信号通路调控miR-9/IGF-1轴，抑制成纤维细胞的增殖和胶原蛋白的产生，从而达到治疗瘢痕的作用[17]，或作用于microRNA-29激活p38 MAPK-JNK通路，以延缓胶原的过度增殖和沉积，从而治疗增生性瘢痕[18]。黄芩素亦可抑制MMP-2、MMP-9和组织蛋白酶来防止胶原降解[19]。此外黄芩素还具有抗菌[20]、抗氧化[21]、抗肿瘤作用[22]。红细胞溶血实验表明，黄芩素对眼睛无刺激性，对人体作用温和[23]。

本实验研究发现，黄芩素可能通过降低痤疮模型组织中IL-4、MMP-9的含量，进而调控炎性介质的发展并减少后期痤疮瘢痕的形成。在临床诊疗的过程中，西医治疗痤疮容易反复，且存在使皮肤干燥、瘙痒、疼痛、色素沉着等副作用[24]。而中药口感较差，有些患者不愿长期服用。外用黄芩素治疗痤疮疗效确切，在临床中有较好的应用前景。