荧光定量PCR方法在结核分枝杆菌复合群检验中的应用价值

王纯华 郭秋霞 谢汉彬

广东省汕头市第三人民医院检验科，广东汕头 515000

结核病是危害我国公共卫生健康安全的重要疾病之一，尽早诊断结核病对于预防该病的传播具有重要意义[1]。目前临床诊断结核病的方法仍旧是采取实验室培养的方式，但是这种方式的耗时长，检验效率低下，无法进行大数据筛查[2]。荧光定量PCR方法是一种高效且灵敏度、特异度较高的检验方法，能够有效鉴别结核分枝杆菌复合群的实际状态，从而指导临床诊断与治疗，做出更加科学的决策[3]。为了进一步分析荧光定量PCR方法的应用价值，本研究选取2019年6月至2020年6月医院接收436例结核可疑患者共计470份临床样本进行对照观察，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2019年6月至2020年6月医院接收436例结核可疑患者，其中男225例，女211例；年龄19～68岁，平均（41.0±8.6）岁，共计470份临床样本（其中414份为肺内样本，56份为肺外样本），本研究样本中肺内样本主要为痰液样本，肺外样本包括了胸腔积液、淋巴结液、尿液、脓液等样本。入选患者均对本研究知情并签署同意。

1.2 方法

1.2.1 实验室培养 将痰，胸腔积液、淋巴结液、尿液、脓液等样本进行前处理后放入改良罗氏培养基中培养。

1.2.2 荧光定量PCR法检测方法 将痰液化后和胸腔积液、淋巴结液、尿液、脓液等样本离心，取沉淀进行灭活，结束后至室温离心然后将样本加入结核杆菌复合群核酸检测试剂增强液到Lab Aid 824提取仪提取核酸。将待测样本及阴阳对照品加入TB-DNA提取液分装至8联管孔上SLAN-96SPCR扩增。仪器PCR反应程序：先使用50℃ UNG处理，持续时间为2 min，之后使用95℃ UNG酶失活，预变性10 min，之后Touchdown循环程序10个，PCR循环程序45个，之后根据标准曲线计算CT值。本研究采用SLAN-96S核酸扩增仪、BD BACTEC MGMT960结核分枝杆菌培养仪、培养管批号：国械准进20142405711，结核分枝杆菌复合群核酸检验剂批号为：20112601。

1.3 观察指标及评价标准

以实验室培养为金标准，分析荧光定量PCR法的检验结果，并观察荧光定量PCR方法检测结核分枝杆菌复合群的灵敏度与特异度。灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%。特异度=真阴性例数/（真阴性例数+假阳性例数）×100%。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件进行统计分析。

2 结果

2.1 荧光定量PCR法肺内样本检测结果

在414份肺内样本中，培养阳性共计60份，培养阴性共计354份，荧光定量PCR检测中灵敏度为97.8%，特异度为97.5%，见表1。

表1 荧光定量PCR法肺内样本检测结果

2.2 荧光定量PCR法肺外样本检测结果

在56份肺外样本中，培养阳性共计12份，培养阴性共计44份，荧光定量PCR检测中灵敏度为100.0%，特异度为94.4%，见表2。

表2 荧光定量PCR法肺外样本检测结果

2.3 荧光定量PCR法总样本检测结果

本研究结果显示，荧光定量PCR检测中灵敏度为98.2%，特异度为97.2%，见表3。

表3 荧光定量PCR法总样本检测结果

3 讨论

结核病是一种传染性疾病，自抗结核病治疗方案应用以来，耐药以及耐多药结核病的发生率不断升高，同时存在HIV以及结核分枝杆菌双重感染的风险，加上全球人口流动性的提高使得结核病的发生率有所升高，即使是欧美国家也有出现反弹的情况[4]。根据世界卫生报告组织调查显示，世界有超过1/3的人感染了结核杆菌，也就是有超过20亿人感染结核杆菌，而活动性肺结核患者数量超过2000万，每年新增结核病患者超过300万，我国是结核病高发国家之一，活动性肺结核患者数量位居全球第二，根据我国流行病调查结果显示，我国活动性肺结核患者超过600万，且传染性肺结核患者超过200万[5]。因此防治结核病是我国临床医学研究的重要课题。

结核分枝杆菌在干痰中存活6～8个月，如粘附在尘埃上传染性可保持8～10 d，在酸性溶液中能够存活30 min，但是对紫外线以及酒精的抵抗力弱，太阳直射2～3 h失活，75%乙醇接触后数分钟内死亡[6]。近年来随着该病发生率的升高，发现耐药性与耐多药结核分枝杆菌不断增多，甚至出现流行的趋势[7]。耐药结核杆菌感染使得临床治疗越来越复杂，尤其是对异烟肼、利福平耐药的患者。

结核杆菌感染可分为原发性感染与继发性感染[8]。原发性结核杆菌感染常见于儿童、老年人以及免疫力低下人群，主要是由于结核杆菌随着飞沫以及灰尘进入肺泡，而巨噬细胞吞噬结核杆菌之后由于吞噬体与细胞壁上的碳酸脑苷脂结合从而无法起到杀菌的作用，使得结核杆菌大量生长，引起炎症病灶[9]。随着机体免疫反应的作用，原发病灶能够自愈，但是其中潜伏着一些结核杆菌，在不断免疫反应的刺激下形成抗结核免疫力，也可以作为条件感染的病因[10]。少量免疫力极低患者可能经淋巴、血流引起全身结核或结核性脑膜炎[11]。继发性感染常见于成年人，主要特征为病灶局限并形成慢性肉芽肿性炎症，形成结核结节，出现干酪样坏死[12]。结核杆菌虽然具有较高的感染率，但是发病率相对较低，由此可见人体感染结核杆菌之后能够形成一定的免疫力，且主要体现在细胞免疫上。

目前临床诊断结核病主要是采取实验室培养为金标准，但是其检验时间长，容易错过疾病治疗的最佳时间，并且可能造成该病的传播。因此为了尽可能提高结核病的临床诊断结果，需要采取更加有效的检验方法[13]。荧光定量PCR方法是临床检验的常用方法，主要采取决定定量和相对定量，前者主要是利用已知标准曲线来计算样本量，而后者则主要是利用靶序列相对于另一组参照序列的变化信息计量[14]。荧光定量PCR方法目前在临床医学中有着广泛的应用，其在HIV、结核杆菌、巨细胞病毒、EB病毒等病原体检测中具有较好的应用价值[15]。

荧光定量PCR方法不仅能够对病原体进行定性定量分析，同时由于差异小、重复性好的优势，能够定量病原体DNA、RNA，最主要的是能够对病原体复制与活动情况进行动态观察，从而为疾病检查确定观察，例如抗病毒治疗效果、药敏测试等。荧光定量PCR方法在临床应用过程中发现与结核杆菌核算量与该病的发生、发展以及预后之间有密切的相关性，且样本中细胞因子含量低的情况下也有着较高的敏感性与准确性，因此对于该病的临床诊断与治疗评估有着较好的应用价值。本研究中414份肺内样本中，培养阳性共计60份，培养阴性共计354份，荧光定量PCR检测中灵敏度为97.8%，特异度为97.5%；在56份肺外样本中，培养阳性共计12份，培养阴性共计44份，荧光定量PCR检测中灵敏度为100.0%，特异度为94.4%。以本研究总样本的培养结果来看，荧光定量PCR检测中灵敏度为98.2%，特异度为97.2%，由此可见荧光定量PCR方法具有较好的应用效果，能够有效提高结核病的临床诊断准确率，有助于患者尽早进行治疗，从而改善患者的预后情况。

综上所述，荧光定量PCR方法在结核分枝杆菌复合群临床检验中具有较高的灵敏度与特异度，值得推广应用。