云南栘SRAP-PCR反应体系的建立及引物筛选*

陈 璨，石 辰，王大玮 ，彭劲谕，段安安

(1.西南林业大学，西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室，云南 昆明 650224；2.西南林业大学，云南省高校林木遗传改良与繁育重点实验室，云南 昆明 650224)

SRAP标记即序列相关扩增多态性(sequencerelated amplified polymorphism)凭借其操作简单、可靠和信息量高等优点，已经广泛应用于遗传多样性分析[12-13]、遗传图谱构建[14]、亲缘关系分析[15]以及种子纯度鉴定[16]等方面。近年来，SRAP-PCR反应体系已成功在苹果[17]、山梨[18]和思茅松[19]等物种建立，为其遗传多样性的研究提供了技术支持。本研究旨在分析TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、模板DNA及引物5种因素对SRAP-PCR反应体系的影响，建立云南栘SRAP-PCR体系，并筛选出有效的SRAP-PCR引物，为后续云南栘遗传多样性分析提供技术支持，以期为合理制定中国西南地区这一特色野生资源的遗传改良策略以及野生种质资源的开发利用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

研究材料为木里(N27°95′，E101°27′)、澜沧(N22°59′，E100°17′)和盈江(N25°20′，E98°16′)3个云南栘天然群体，每个群体随机采集10株长势较好的云南栘植株的幼嫩叶片，储存于-80 ℃ 条件下备用。SRAP-PCR体系建立的模板DNA来自澜沧1号云南栘群体(N22°59′，E100°17′)，引物由生工生物工程(上海)技术服务公司合成。

1.2 试验方法

采用张鲁杰等[20]的CTAB法并加以改进，对采集样本基因组DNA进行提取。所得样本DNA的质量通过1%琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白测定仪2种方法进行检测。

1.2.2 SRAP-PCR反应体系及程序

表1 SRAP-PCR 反应因素及水平Tab.1 Reaction factors and levels of SRAP-PCR

表2 SRAP-PCR 反应因素水平 L16(45)正交试验设计Tab.2 L16(45) orthogonal test deign of SRAP-PCR

1.2.3 引物筛选

1.2.4 SRAP-PCR体系的稳定性检测

根据建立的SRAP-PCR反应体系对木里、澜沧和盈江3个天然群体的云南栘基因组DNA分别进行扩增，对云南栘SRAP-PCR体系进行稳定性检测，采用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法对所得的扩增产物进行分离检测，拍照保存结果。

1.2.5 数据整理与分析

利用张丽等[23]的方法，对正交试验结果进行直观分析，依据扩增条带的清晰度和稳定性对16个组合的PCR扩增结果进行评分，条带数量最多、清晰度最高的产物记为16分，最差产物记为1分。依据评分结果，Ki为同一水平参与反应的各因子的试验值之和，ki为该水平参与反应的数据平均值，同一因素下ki最大值减去ki最小值即为该因子的极差(R)。R的大小与各个因素对SRAP-PCR 反应体系影响的大小成正比，R越大则该因素对反应影响越大，反之，R越小则对反应结果影响越小。ki反映了因素在各水平条件下对反应体系的影响，当ki达到最大值时，该因素在当前水平下达到最佳值。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA质量

图1 部分云南栘样品DNA检测结果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results of genomic DNA of some Docyina delavayi

2.2 SRAP-PCR反应体系的建立

依据扩增产物对16个组合的PCR (图2)进行评分，1～16号组合的评分结果(表3)显示：第3、4、11和14泳道条带数量较多且相对清晰，得分较高，其中，第4泳道条带亮度最高，多态性好，得分最高，为16分；第1、2、8和9泳道条带较少，亮度低，且存在弥散现象，得分较低，其中，第9泳道条带最少亮度最弱，得分为1分。

表3 正交试验电泳条带得分值Tab.3 Score of electrophoresis band in orthogonal test

图2 云南栘 SRAP-PCR 反应体系的正交试验结果Fig.2 The amplified results of D.delavayi SRAP-PCR orthogonal test

由R值(表4)可知：各因素对云南栘SRAPPCR反应体系的影响由小到大排列为：dNTPs<模板DNA

表4 正交试验结果统计Tab.4 Statistic results of the orthogonal test

2.3 云南栘 SRAP-PCR引物组合筛选

表5 SRAP 引物组合及扩增结果Tab.5 Primer pairs of SRAP and their amplification results

2.4 SRAP-PCR体系的稳定性检测

图3 引物 Me6/Em2 对建立体系进行验证结果Fig.3 The SRAP-PCR results with the primer of Me6/Em2

3 讨论

SRAP标记对基因组DNA的质量浓度要求较低，但基因组DNA的质量和纯度是直接导致PCR扩增反应效果和重复性好坏的关键性因素[24]。云南栘叶片中富含多糖和多酚等多种次生代谢物[25]，容易与DNA结合形成难以溶解分离的胶状化合物，从而影响基因组DNA的质量，造成DNA得率下降等负面影响[26]。本研究以云南栘的幼嫩叶片为试验材料，在传统CTAB提取法上针对多糖和多酚类物质进行改良，在液氮研磨的过程中加入PVP-40粉末，并在提取过程中加入适量的β-巯基乙醇，最大限度地减少酚类杂质与基因组DNA的结合，有效降低了多酚物质在提取过程中因氧化产生的褐化现象[27]。经琼脂糖凝胶及微量核酸蛋白仪检测，验证了用该方法获得的基因组DNA符合SRAPPCR反应的要求，为后续分子试验奠定了基础。

已有的SRAP-PCR体系建立大多采用单因素多水平分析法，此方法可以直观了解各因素对SRAP-PCR扩增反应产生的影响[28-29]，但在PCR反应体系中，这些主要因素之间往往存在一定程度的相互作用与影响，单因素多水平分析法无法明确各个因素之间的相互影响[30]。正交试验设计是利用统计学原理，对各因素在不同水平下的交互作用进行研究的一种试验方法[31]，具有均衡分散和整体可比的特点，通过较少的试验便可全面了解试验的情况，从而能快速地确定最佳体系组合[32]。本研究采用L16(45)正交试验设计，建立了云南栘25 µL的SRAP-PCR反应体系，结果表明：引物、Mg2+、dNTPs和TaqDNA聚合酶对云南栘SRAP-PCR反应体系有一定影响，各因素对云南栘SRAP-PCR反应体系的影响由小到大排列为dNTPs<模板 DNA

SRAP标记在海南油茶[34]、河南辛夷[35]、杨树[30]和思茅松[19]等植物中均有应用，且能较好地扩增出多态性条带。在众多遗传多样性研究中，SRAP分子标记有较大的利用率，在中国新疆野苹果[36]和湖北油茶[37]的遗传多样性分析中，分别使用了10对和11对SRAP引物，扩增得到的多态性位点百分率都较高。证明SRAP分子标记在亲缘关系判断、遗传多样性分析以及分子标记辅助育种等方面具有巨大的研究潜力。本研究共筛选出20对多态性较好的SRAP引物组合，共扩增出212条带，其中187条具有多态性，占比为88.21%，进一步佐证了SRAP 分子标记在云南栘群体中可以获得较高的多态性，适合应用于云南栘的遗传多样性分析。

4 结论