云烟87内生真菌多样性及其促生作用评估*

谢佳伟，彭小祠，陈小巧，谭明华，刘彦中，郝 冰

(云南农业大学 烟草学院，云南 昆明 650201)

植物内生菌是影响植物生长的重要生物因素之一，内生菌通过自身的生命活动，依靠自身功能及产生的次级代谢产物对植物体产生直接或间接的影响，包括促进共生植物的生长发育、直接干预植物防御系统和激素调控等作用[1-2]。目前对于烟草内生菌促生作用的研究主要集中于内生细菌，如梭状芽孢杆菌(Clostridiumsp.)含有大量固氮酶，可为烟草提供无机氮源，进而提高烟叶的产量和品质[3]；烟草内生促生细菌wy2和解淀粉芽孢杆菌 YN201448能够促进烟草种子萌发、幼苗茎粗和根系生长[4-5]，但对于烟草内生真菌促生效果的研究较少。

有关植物内生真菌促生作用的研究主要集中于粮食作物。已有研究表明：从野生大豆分离的内生真菌Y6R15可抗大豆疫霉病和玉米大斑病，且对玉米和大豆均有促生作用[6]；从禾草根部分离的内生真菌LC-R-311能显著提高玉米幼苗的多项生理指标、叶绿素含量和SOD酶活性，显著降低ABA含量[7]；稻镰状瓶霉可显著提高水稻的多项农艺性状指标，提高光合强度[8]；深色有隔内生真菌对甘蔗的生物量和株高等有促进作用[9]。本研究对云南烤烟主栽品种云烟87的内生真菌进行分离鉴定，筛选具有显著促进云烟87、云烟97、K326和红花大金元烟苗生长功能的菌株，将促进烟草不同部位生长的菌株根据实际生产需要运用于烟草生长的不同时期，为功能内生真菌的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 植物材料

内生真菌分离所用3株长势一致的成熟健康云烟87烟株于2019年7月21日采自昆明寻甸(N25.518°，E103.278°，海拔1 865 m)；内生真菌发酵液促烟苗生长试验所用烟苗培养于云南昆明西南生物多样性实验室。

1.2 培养基

内生真菌分离培养基采用含10 mg/L硫酸链霉素的PDA固体培养基；内生真菌发酵液促烟苗生长试验采用含10 mg/L硫酸链霉素的PDA液体培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 云烟87内生真菌的分离纯化

参考王利娟等[10]植物内生真菌的分离培养方法，将采回的云烟87植株截取上部叶、中部叶、下部叶、茎、主根和须根等6个部位的健康组织，分别用无菌水冲洗，除去表面泥土，并用滤纸吸干表面水分。组织表面消毒步骤为：(1) 叶部：75%酒精浸泡30 s→0.1%升汞浸泡15 s→无菌水冲洗3次；(2) 茎部：75%酒精浸泡30 s→除去表皮保留皮层及中柱；(3) 根部：75%酒精浸泡60 s→0.1%升汞浸泡20 s→无菌水冲洗3次，将最后1次冲洗后的无菌水划线于PDA平板之上，作为对照，以检验样品的消毒是否彻底。接种分离步骤为：将烟叶部分置于研钵中加入无菌水研磨，将研磨液和残渣均匀地铺放在培养基表面；将烟茎部分用接种刀切成5～8 mm小块，铺放在培养基表面；将粗根部分用接种刀切成3～5 mm小段，切面朝下铺放在培养基表面；将须根部分于研钵中加入无菌水研磨，将研磨液和残渣均匀地铺放在培养基表面。

全部材料置于28 ℃恒温培养箱中培养5～7 d，观察菌落生长状况。将培养分离出的不同种类的内生真菌接入PDA培养基进行纯化，2～3次点接纯化直到菌落单一。由于不同真菌的繁殖速度不同，可以优先分离纯化生长较快的菌株，生长较慢的待其稳定后再进行分离纯化。

1.3.2 云烟87内生真菌的鉴定

参照CTBA 法[11]提取真菌基因组DNA。ITS扩增使用的通用引物为ITS1 (5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′) 和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)，由昆明擎科生物科技有限公司合成，使用的PCR试剂盒为T5 Direct PCR Kit(Plant)，由昆明擎科生物科技有限公司生产。PCR 反应体系为：25 μL T5酶，2 μL ITS4，2 μL ITS5，1 μL DNA 模板，用 ddH2O 补足至50 μL。扩增程序为：98 ℃ 3 min，98 ℃ 10 s，54 ℃10 s，72 ℃ 10 s，35个循环，72 ℃ 5 min，4 ℃保存。对琼脂糖凝胶电泳分析后的扩增产物进行测序，测序结果通过BLAST比对鉴定菌种所属种类，并参考文献[12]，结合内生真菌的菌落特征和显微形态特征确定所属菌种。在GenBank核苷酸数据库中挑选出同源性较为相近的真菌DNA序列，再通过软件MEGA 4.0按邻接法(neighbor-joining)构建所有种属以及促生菌株的内生真菌的系统发育树。

1.3.3 云烟87内生真菌的液体发酵

将分离纯化的全部内生真菌菌株各取大小约1.5 cm2的菌块接入100 mL液体PDA培养基中，装入250 mL锥形瓶内，瓶口封膜，于摇床振荡培养，培养温度30 ℃，转速220 r/min，培养48～72 h，备用。

1.3.4 云烟87内生促生菌株的筛选

前期在适宜条件下培育烟苗，育苗盘规格为12 cm×16 cm，12孔穴，每盘每列从左到右分别种植云烟97、云烟87、K326和红花大金元，每穴播种3颗烟草种子，待烟苗生长到5～6片真叶时，挑选长势一致的烟苗进行促生试验，每穴保留1株烟苗。每穴取3 mL内生真菌发酵液摇晃均匀，对烟苗的地上部分和根部土壤进行浇施处理；浇菌后，育苗盘上部盖上透明隔离罩，放入培养箱中继续培养。另设置对照烟苗，正常培养，不浇施菌液。待烟苗生长到7片真叶时，统计烟苗的鲜质量、根鲜质量、地上部鲜质量、株高、最大叶长、最大叶宽和根长共7个指标的数据，挑选促生效果显著的菌株。按照增长率公式计算各个指标的增长率(3次重复试验的均值)。

1.4 数据统计与分析

采用Excel 2010、SPSS 23.0、MEGA 4.0和Origin 2018软件进行数据统计与作图分析，显著性分析应用LSD新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 云烟87内生真菌的分离与鉴定

从田间采摘的3株云烟87的不同部位共分离出103株内生真菌，包括：尖孢镰刀菌、土曲霉、Aspergillus lentulus、球毛壳菌、互隔交链孢菌、广生茎点霉和朱黄篮状菌等53种真菌，其菌群结构以及不同菌种之间的进化关系见图1。其中，尖孢镰刀菌和土曲霉为主要优势种，分别占分离菌落总数的13.59%和12.62%。内生真菌隶属于镰孢菌属(Fusarium)、毛壳菌属(Chaetomium)、曲霉属(Aspergillus)、青霉属(Penicilium)、链格孢属(Alternaria)、木霉菌属(Trichotderma)、拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis)、茎点霉属(Phoma)和篮状菌属(Talaromyces)等29属，其中，曲霉属、镰孢菌属、篮状菌属和链格孢属为主要优势属，分别占总属数的23.30%、20.39%、7.77%和6.80%。由表1可知：在云烟87上部叶共分离出10属11种内生真菌，中部叶和下部叶分别分离出7属8种内生真菌，茎部共分离出8属11种内生真菌，主根共分离出13属22种内生真菌，须根共分离出5属7种内生真菌。

表1 云烟87不同部位烟草内生菌种类Tab.1 Endophytic fungi in different parts of Yunyan87

图1 云烟87内生真菌系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree of endophytic fungi in Yunyan87

2.2 云烟87不同部位内生真菌的群落差异

由图2可知：从成熟健康的云烟87分离出的103株内生真菌中，从叶部分离出25种共30株内生真菌，占分离菌落总数的29.13%，包括上部叶11株，中部叶10株，下部叶9株，链格孢属(Alternaria)是叶部内生真菌的主要优势属；从茎部分离出11种共20株内生真菌，占分离菌落总数的10.68%，尖孢镰刀菌和朱黄篮状菌为茎部内生真菌的主要优势种；从根部分离出27种共53株内生真菌，占分离菌落总数的51.46%，包括主根38株，须根15株，土曲霉为根部内生真菌的主要优势种。总体而言，内生真菌种类和数量为根部>叶部>茎部。其中，在云烟87的根、茎、叶中有2种内生真菌共同存在，分别为尖孢镰刀菌和Aspergillus lentulus；在根、叶中有4种内生真菌共同存在，分别为尖孢镰刀菌、A.lentulus、烟曲霉和草酸青霉菌；在根、茎中有5种内生真菌共同存在，分别为尖孢镰刀菌、A.lentulus、土曲霉、广生茎点霉和毛栓菌；在茎、叶中有3种内生真菌共同存在，分别为尖孢镰刀菌、A.lentulus和互隔交链孢菌。

图2 不同部位内生真菌的种数和差异Fig.2 Species and differences of endophytic fungi in different parts

2.3 促生菌株的筛选、鉴定

由图3可知：经筛选的001E-5、001H-10和001I-26等3株促生菌株处理的烟苗与对照存在明显差异，促生效果良好。

图3 3种促生菌株对不同品种烟苗的促生效果Fig.3 Promotion effect of three plant-promoting fungi on toabcco seedlings

对3株促生效果最明显的内生真菌进行序列同源性分析及系统发育树的构建(图4)，并结合其菌落特征和显微形态特征分析，结果表明：3株具有显著促生作用的内生真菌分别为尖孢镰刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黄篮状菌(001I-26)。

图4 促生菌株的系统发育树及形态特征Fig.4 Phylogenetic tree and morphological characteristics of growth-promoting fungi

2.4 促生菌株对不同品种烟苗的影响

由表2可知：经尖孢镰刀菌处理的云烟97烟苗的株高、鲜质量及地上部鲜质量增长最为显著，分别比对照增长107.64%、153.97%和167.09%，分别比红花大金元烟苗显著高98.58%、135.14%和147.23%，云烟87和K326之间的上述3项指标增长率没有显著差异；云烟97烟苗的最大叶长增长最为显著，比对照增长61.02%；在最大叶宽方面，云烟97增长率显著高于其他3个品种，比对照烟苗增长53.03%；K326烟苗的根长和根鲜质量增长最为明显，分别比对照显著增长50.75%和111.75%。

经土曲霉处理的烟苗在株高和根长方面有所增长，但品种间差异不显著；红花大金元烟苗的最大叶长和最大叶宽增长显著低于其他3个品种；云烟87烟苗的鲜质量、根鲜质量和地上部鲜质量增长最为显著，分别比对照烟苗增长172.85%、209.57%和169.18%。

经朱黄篮状菌处理的K326烟苗的鲜质量、根鲜质量和地上部鲜质量增长最为显著，增长率分别比红花大金元高27.62%、10.45%和29.45%；云烟87烟苗株高增长最为明显，增长率显著比红花大金元高31.35%；红花大金元的最大叶宽增长最明显，比K326烟苗显著高20.47%；云烟97烟苗的根长增长率最明显，显著高于红花大金元20.06%。

由表2还可知：尖孢镰刀菌对云烟97烟苗株高、鲜质量以及地上部鲜质量的促生作用最好；而土曲霉对其烟苗根鲜质量促生作用最明显，比对照烟苗增长169.21%。就云烟87而言，经土曲霉处理后，其烟苗的鲜质量、根鲜质量及地上部鲜质量增长率显著高于其他2个菌种；而朱黄篮状菌处理对其烟苗株高增长最明显，比对照烟苗增长71.66%。就K326而言，尖孢镰刀菌对其烟苗根鲜质量和根长的促生效果最明显；土曲霉对其烟苗的鲜质量和地上部鲜质量影响最为明显，分别增长108.53%和109.52%。经朱黄篮状菌处理的红花大金元烟苗的地上部各项性状指标均显著高于其他2个菌种处理的烟苗，其中株高、最大叶长和最大叶宽增长率分别为40.31%、24.21%和28.17%；此外，经土曲霉处理的红花大金元烟苗根鲜质量增长率为121.47%。

3 讨论

从云南省栽培的成熟云烟87植株分离出103株内生真菌，其中曲霉属和镰孢菌属为主要优势属，这与裴洲洋[13]对河南9个烟草品种内生真菌的分离结果不同。同时，本研究表明：云烟87根部和叶部分离出的内生真菌的多样性高于茎部，这与湖北栽培云烟87茎部内生真菌多样性最高的结论[14]相反。本研究进一步证实：不同地域土壤条件下的菌群差异可导致内生真菌在植株体内定殖群落和部位存在差异。有研究表明：内生真菌具有不同的组织偏好性[15]，本研究中的优势菌种尖孢镰刀菌集中分布于根部和茎部，而另一优势菌种土曲霉主要分布于根部，而叶部内生真菌主要优势属为链格孢属(Alternaria)。

通过烟苗促生试验筛选出的3株内生真菌对不同品种烟苗以及烟苗不同生理指标的影响也存在差异。云烟87和K326在促生菌株的处理下，除个别生理指标外，整体增长趋势较为一致，这可能是由于K326是云烟87的父本，亲缘关系较近，真菌促生机理相似。尖孢镰刀菌和朱黄篮状菌分别对云烟97和红花大金元的促生效果整体最为显著，推测2种菌株分别在2个品种烟草中的菌群密集度更高或者烟草对菌的适应性更强。

尖孢镰刀菌对4个品种烟苗的多项生理指标均表现出明显的促进作用，可能是由于该菌在烟株体内的分布较为广泛，且分离出的尖孢镰刀菌为非致病性尖孢镰刀菌。已有研究表明：非致病性尖孢镰刀菌可以从健康植株根茎部以及土壤中分离出[16]，可促进番茄种苗生长[17]；此外，杨猛等[18]研究发现：非致病性尖孢镰刀菌可以提高西瓜和黄瓜的株高和鲜质量以及植物中赤霉素的含量，这些结果与本研究中表现出的烟草促生效果一致。在真菌群落丰度较低或未达到饱和状态时，尖孢镰刀菌与其他内生真菌相比，对于营养元素以及侵染位点的竞争更大，这就使植物免疫进一步提高，从而促进植物生长。

本研究表明：土曲霉可促进4个烟草品种的根部生长。已有研究表明：土曲霉通过产生一系列抑菌代谢产物，在根部土壤微环境中创造一个促进根生长的菌群环境，进而限制其他菌种对植物体内营养的消耗，促进根部生长[19-20]。因此，在烟草漂浮育苗过程中适当施加土曲霉，将有效促进烟苗根部生长，达到促根壮苗的效果。

朱黄篮状菌大多分离自玉米和石榴等植物，本研究首次从烟草中分离出该菌。研究表明：朱黄篮状菌可产生较多的淀粉酶[21]，云南篮状菌(Talaromyces yunnanensis)能够溶磷[22]，经朱黄篮状菌处理烟苗的地上部分促生效果相对更为显著，这可能是由于产生的大量淀粉酶使烟叶中的淀粉加速水解为糖类或者促进土壤中的矿化磷转化为水溶性磷，为烟苗地上部生长提供更多的能量。此外，LIMA等[23]和CHEN等[24]研究发现：朱黄篮状菌的次生代谢产物中包含许多萜类化合物，但目前对于该菌的研究较少，其次生代谢物作用有待进一步验证。

综上所述，不同促生菌株的具体作用部位存在差异，因此，在烟草生长的不同时期施加可促进不同部位生长的功能菌株，有针对性的单独或混合使用促生菌株，可达到促进根部生长、调节烟苗根茎比例和叶片数的目的，从而提高烟苗成活率和烟草质量。

4 结论

本研究从云南烤烟主栽品种云烟87不同部位分离到53种103株内生真菌，其中曲霉属和镰孢菌属为主要优势属。3株显著促进烟苗生长的菌株经分子生物学鉴定为尖孢镰刀菌(001E-5)、土曲霉(001H-10)和朱黄篮状菌(001I-26)，001E-5和001H-10对云烟97、云烟87和K326的鲜质量提高均在91%以上。研究结果为烟草内生菌株的促生菌剂研发提供了理论依据。