2种木霉菌肥对马尾松幼苗生长及抗立枯病的影响*

蒋仙，祝静，于存

(贵州大学 林学院，贵州 贵阳 550025)

木霉菌(Trichodermaspp.)在抵御病原菌对植物的侵害过程中发挥了重要的作用，是目前应用最广泛的控制土传病害的生防真菌。木霉菌可以通过直接拮抗植物土传病原菌、改善植物营养状况、诱导抗病物质积累和防御酶体系建立等途径提高植物对土传病害的抗病性[1]。木霉防治病害的主要机制包括：通过代谢产物抑制病原菌生长，激发植物免疫系统[2]，以及通过营养竞争、菌丝缠绕、分泌抑菌的代谢产物等多种机制进行病害的防治[3]。袁玉娟等[4]研究发现木霉通过产生木霉素、胶霉素、绿木霉素、抗菌肽等抑制植物病原菌生长。涂晶晶等[5]研究发现拟康宁木霉(Trichodermakoningiopsis)Hailin菌株对尖孢镰孢菌(Fusariumoxysporum)产生明显抑制，并且可以有效地提高马尾松(Pinusmassoniana)对立枯病的抗性。另外，木霉在对多种植物病害发挥防治作用的同时，还可以促进植物的生长。如张树武等[6]研究发现深绿木霉(T.atroviride)可以通过改善植株的叶绿素含量、可溶性蛋白质含量等生理指标的方式来促进白三叶草(Trifoliumrepens)的生长。然而，木霉菌在田间应用时易受环境条件影响使其防病和促生效果不稳定[7]。因此，将木霉菌制作成固态菌肥可以有效提高其在土壤中的定殖率，还可以极大地改善木霉活体储存期短、使用不方便等缺点。木霉菌肥是一种微生物活体制品，可以通过自身生命活动的方式来促进植物对营养元素的吸收，使得植物获得特定的肥料效应[8]。木霉菌肥施用后可在土壤内快速繁殖，短时间即可形成优势群体，优势群体可以提高土壤酶活性，使不溶性土壤养分溶解，促进植物对养分的吸收，提高土壤中养分的循环转化，促进形成良好的根际环境[9]。以往已有较多利用木霉菌肥促进植物生长的例子，不同植物开发特定功能的木霉菌肥配方对不同植物的促生和防病具有重要的意义[10]。

马尾松是松科(Pinaceae)松属(Pinus)的常绿乔木，是我国南方重要的山地造林先锋树种[11]。因马尾松苗期栽植密度大、短期集约式育苗导致的土壤肥力下降已成为遏制马尾松育苗产业健康发展的重要限制因子[12]。此外，马尾松在幼苗期病害频发，使得马尾松在育苗造林和资源利用上受到了严重制约，而立枯病被认为是马尾松苗期最严重的病害之一，严重时可致80%幼苗的死亡[13]。目前，利用生物菌肥代替传统的化学肥料和农药进行林木促生和病害防治是现代林业的发展方向之一。以往主要通过利用外生菌根菌来对马尾松的生长进行研究，但外生菌根菌对马尾松的作用受温度、pH环境条件和菌根菌在根部的有效侵染等因素的限制[14]。而木霉可以定殖于土壤和植物体内，进而发挥促生和病害防治的功能，针对马尾松开发高效的木霉菌肥，对马尾松的促生和病害的生物防治具有重要的现实意义。

本研究分别以长枝木霉(T.longibrachiatum)菌肥和拟康宁木霉菌肥处理马尾松幼苗，研究2种木霉菌肥对马尾松苗生长、生理和马尾松苗立枯病的抗性，进而为木霉菌肥在马尾松促生及立枯病防控上的应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株为长枝木霉、拟康宁木霉和尖孢镰孢菌，由贵州大学林学院提供，采用PDA斜面保存于贵州大学森林保护实验室4 ℃冰箱中；供试土壤采自贵阳市花溪区贵州大学马尾松人工林；供试马尾松种子由贵州省都匀市马鞍山林场马尾松国家林木良种基地提供；供试珍珠岩和蛭石由贵州格瑞恩生物技术有限公司提供；供试菌肥是由木霉菌液(106cfu/mL)按每克基质接入0.3 mL的菌液比例添加到混有菜籽油饼和麦麸[菜籽油饼(m)︰麦麸(m)=3︰7]的固体基质中，每克基质添加2 mL MendeLs营养液和2.5 mL蒸馏水，用0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl调整基质的pH值为6.0，于28 ℃恒温箱中培养7 d后获得孢子浓度为1011cfu/g的木霉菌肥。MendeLs营养液的组成为：(NH4)2SO44 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO42g/L、CaCl2·2 H2O 0.3 g/L、FeSO4·7 H2O 5 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl22 mg/L，蒸馏水定容至1 L；菜籽油饼和麦麸购自贵阳花溪区农贸市场；木霉和尖孢镰孢菌的培养采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)和马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)。

1.2 试验方法

1.2.1 试验设计

采用室内盆栽试验，将菌肥与基质土(马尾松林土︰蛭石︰珍珠岩=6︰3︰1)混匀后移栽5个月生马尾松幼苗，每1 000 g灭菌基质土中加入10 g的木霉菌肥，使得每克基质土中木霉孢子浓度为109cfu/g。采用伤根浸泡法和灌根法将尖孢镰孢菌菌液(孢子浓度为106cfu/ml)接种至马尾松苗根部[15]。设置6个处理，分别为：菌肥基质(CK)、长枝木霉菌肥(P1)、拟康宁木霉菌肥(P2)、菌肥基质+尖孢镰孢菌(Fo)、P1+Fo和P2+Fo。每个处理30盆，每盆移栽4株幼苗。于2020年5月在贵州大学西校区林学院温室内进行。将盆栽幼苗置于温室内培育，统一管理培育60 d后，对马尾松幼苗的生长指标、根际土壤养分、病害发生率及抗病生理指标进行测定。

1.2.2 指标测定

(1)马尾松苗生长及生物量测定 不同处理马尾松苗60 d后，每个处理随机选取10株幼苗，使用卷尺测量并记录苗高。自地径处将新鲜马尾松幼苗剪断，将幼苗分为地上和地下两部分。以上样品用流水反复冲洗直至洗净，使用滤纸吸干表面多余水分后，测量主根长并统计侧根数，同时对洗净的地上和地下部分的样品进行生物量的测定，叶片和根系的鲜重利用十万分之一的电子天平称量，然后放入80 ℃烘箱烘至恒重后，再称量叶片和根系干重。

(2)马尾松苗生理指标测定 取处理60 d后的马尾松苗，利用丙酮提取法测定叶绿素含量[16]。将取完根际土的苗经自来水冲洗干净附着土壤后，用无菌水清洗3次，用无菌滤纸吸干水分，每个处理随机选取3株幼苗，利用TTC法测定根系活力[17]。以上处理均重复3次。

(3)土壤养分测定 取不同处理60 d后马尾松苗，每个处理随机选择10株苗，用无菌毛刷将马尾松根系附近(<4 mm)范围内的土壤刷下后，保存于无菌三角瓶中用于根际土壤养分的测定。土壤养分测定采用鲍士旦的方法[18]。其中，土壤全氮测定采用凯氏定氮法，土壤水解氮测定采用碱解-扩散吸收法，土壤全磷测定采用碱熔-钼锑抗比色法，土壤有效磷测定采用钼锑抗比色法，土壤全钾测定采用消煮液-火焰光度法，土壤速效钾测定采用乙酸铵浸提-火焰光度法。以上每个处理均重复3次。

(4)立枯病发病情况调查及抗病指标测定 采用伤根浸泡法和灌根法对健康的马尾松幼苗进行室内防治试验[15]。病原菌处理马尾松苗60 d后统计马尾松苗立枯病的发病率和发病等级，并计算病情指数和相对防治效果。发病率、发病等级、病情指数和相对防治效果的计算参考Luo X和Yu C[13]的方法。取不同处理马尾松苗，用无菌水洗净后，用无菌滤纸吸干水分，分别收集叶片和根系，并迅速用液氮冷冻后保存于-80 ℃冰箱用于生理指标的测定。POD、SOD及CAT指标测定采用索莱宝生产的BC0090型号试剂盒进行测定。相对电导率的测定采用电导仪法测定[19]。每个处理取120株苗用于幼苗病害发生率、发病等级、病情指数和相对防治效果的统计，以上处理均重复3次。

1.3 统计及分析

运用Microsoft Excel 2019对得到的原始试验数据进行整理，运用IBM SPSS 24统计软件进行方差分析和多重比较。参数均采用单因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比较采用Duncan法进行比较(α=0.05)。表中数据为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 2种木霉菌肥对马尾松幼苗生长及生物量的影响

2种木霉菌肥对马尾松幼苗生长及生物量指标的影响结果见表1。由表1可知，与CK相比，施用P1、P2幼苗的苗高分别高出17.52%和13.93%；施用P1、P2的幼苗根长分别长出82.14%和97.99%；施用P1的幼苗侧根数最多，比CK处理多出81.86%；同时，施用P1的幼苗叶片和根系的鲜重比CK处理分别增加97.06%和60.00%；施用P1的幼苗叶片和根系的干重比CK处理分别增加50.00%和100.00%；施用P2的幼苗叶片和根系鲜重比CK处理分别增加61.76%和20.00%；施用P2的幼苗叶片和根系干重比CK处理分别增加40.00%和50.00%。施用P1、P2的苗高、根长及干鲜重均与CK存在显著差异(P<0.05)。由图1也可看出2种木霉菌肥对马尾松苗生长的促进作用。

表1 2种木霉菌肥处理下马尾松幼苗的生长及生物量指标

图1 2种木霉菌肥处理下马尾松苗生长图

2.2 2种木霉菌肥对马尾松苗生理的影响

2种木霉菌肥对马尾松苗根系活力、叶绿素的影响见图2。由图2A可知，施用P1和P2的幼苗根系活力显著提高，与CK相比，施用P1、P2的幼苗根系活力分别提高45.69%和35.44%；施用P1、P2的幼苗根系活力与CK均存在显著差异(P<0.05)。

由图2B可知，施用木霉菌肥的幼苗叶绿素较CK组有显著的提高，其中施用P1的幼苗叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素分别比CK处理增加90.41%、34.34%和45.90%；施用P2的幼苗叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素分别比CK处理增加93.10%、37.01%和48.39%；同时，施用P1、P2的幼苗叶绿素与CK均存在显著差异(P<0.05)。

图2 2种木霉菌肥处理下马尾松幼苗生理指标

2.3 2种木霉菌肥对马尾松苗根际土壤养分的影响

施用2种木霉菌肥后马尾松苗根际土壤养分的测定结果见表2。由表2可知，施用P1、P2的幼苗土壤全氮、全磷、全钾、水解氮、速效磷和速效钾与CK均存在差异。与CK相比，施用P1幼苗根际土的全氮、全磷、全钾、水解氮、速效磷和速效钾分别提高61.43%、50.68%、47.95%、30.89%、57.92%和29.17%；施用P2的幼苗根际土全氮、全磷、全钾、水解氮、有效磷和速效钾分别提高69.39%、60.27%、54.49%、32.52%、80.79%和18.01%。

表2 2种木霉菌肥处理下马尾松幼苗土壤养分含量

2.4 2种木霉菌肥对马尾松幼苗立枯病的防治效果

2种木霉菌肥对马尾松幼苗立枯病的防治效果见图3。由图3可知，与Fo处理相比，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗发病率分别降低49.09%和54.48%；P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗病情指数分别降低43.75%和58.33%；P1+Fo、P2+Fo处理对幼苗立枯病的相对防治效果分别为49.09%和54.48%。

图3 2种木霉菌肥处理下马尾松幼苗抗立枯病的防治效果图

2.5 2种木霉菌肥对马尾松幼苗抗病生理指标的影响

2种木霉菌肥对马尾松苗保护性酶活性和相对电导率的影响的结果见图4。由图4A可知，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗叶片和根系的SOD活性与Fo均存在显著差异。与Fo相比，P1+Fo处理的幼苗叶片和根系中SOD活性含量分别提高66.67%和61.04%；P2+Fo处理的幼苗叶片和根系中SOD活性含量分别提高43.06%和42.86%。

图4 2种木霉菌肥处理下马尾松幼苗抗立枯病生理指标

由图4B可知，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗叶片和根系的POD活性与Fo均存在显著差异。与Fo相比，P1+Fo处理的幼苗叶片和根系中POD活性含量分别提高113.02%和52.40%；P2+Fo处理的幼苗叶片和根系中POD活性含量分别提高98.07%和43.24%。

由图4C可知，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗叶片和根系的CAT活性与Fo均存在显著差异。与Fo相比，P1+Fo处理的幼苗叶片和根系中CAT活性含量分别提高50.00%和41.73%；P2+Fo处理的幼苗叶片和根系中CAT活性含量分别提高41.94%和35.97%。

由图4D可知，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗相对电导率与Fo均存在显著差异。施用P1处理的幼苗相对电导率最低，其中，与Fo相比，P1+Fo、P2+Fo处理的幼苗相对电导率分别降低34.21%和26.32%。

3 讨论与结论

将功能微生物制作为菌肥可有效提高菌株在植物中的作用效果，进而更好的发挥促生和防治病害的功能[20-21]。木霉对植物的促生作用主要体现在植物根系的各项形态学指标、植株的总根长、根尖数以及株高等方面[22]。本研究中，长枝木霉菌肥和拟康宁木霉菌肥均可不同程度地促进马尾松幼苗的高度和生物量，同时2种木霉菌肥还可以促进马尾松根系的长度、分枝和根系活力，表明2种木霉菌肥均具有培育壮苗的效果。这与拟康宁木霉Hailin菌株可以促进马尾松生长的研究结果相近，但本研究中2种木霉菌肥对马尾松的促生效果显著高于拟康宁木霉Hailin菌株对马尾松苗的促进作用[5]。分析这个差异的原因可能是将木霉制作为菌肥发挥了比木霉菌液更明显的促生作用[20]。以往报道显示，木霉在促进植物生长的同时还可以影响植物的生理生化[23]。本研究中，2种木霉菌肥可以提高马尾松苗的根系活力和叶绿素的含量，同时还可提升苗的保护性酶活性，由此判断2种木霉菌肥对马尾松生长和抗病相关生理都起到了积极的作用，通过本研究可以为未来木霉菌肥在马尾松促生上的施用提供借鉴。这与绿木霉处理可以提升樟子松(Pinussylvetrisvar.mongolica)苗抗氧化酶系统活性的结论相似[24]。本试验还处于盆栽实验阶段，对于野外大田的应用效果目前还不清楚，还需进一步进行野外应用研究。

氮、磷、钾元素是植物生长过程中必需的营养元素，其含量的高低是直观反应植物吸收土壤养分的重要指标[25]。以往已有多个利用微生物提高植物根际土壤养分含量的报道[26]，其主要作用机理是调节微生物的固氮、溶磷、解钾和分泌生长激素等能力[27]。本研究中，2种木霉菌肥可以显著改善马尾松苗根际土壤养分含量。其中，根际土全氮、全磷和全钾的增加可能与木霉菌肥基质加入后，被木霉作用而释放出了更多的氮、磷和钾有关。根际土有效磷、速效钾和水解氮的增加可能与木霉菌具有溶磷能力、固氮能力和降低土壤pH进而活化土壤中的养分有关[28-29]。

通过在植物根部施入生防菌株可以有效地防治土传病害[30]。本研究中，2种木霉菌肥在对马尾松立枯病的防治效果为49.1%和54.5%，要低于刘福平等[31]利用绿粘帚霉对马尾松苗的防治效果61.2%。分析病害防治效果的差异，可能与不同菌株对病原菌的抑制机理不同，进而使其抑菌能力存在差异，也可能和试验所处的外部环境条件如温度、湿度、土壤类型、苗木的大小等有关。以往关于2种木霉对病原菌的直接抑菌机制的报道已经很多[32]。前期研究中发现拟康宁木霉可以通过菌丝缠绕、产生代谢产物与几丁质酶等方式抑制病原菌的生长[5,33]。本研究中发现，2种木霉菌肥均可提高马尾松苗保护性酶的活性，同时，2种木霉菌肥可降低马尾松苗相对电导率，进而减少病原菌对苗木的伤害。结合本研究2种木霉菌肥对马尾松苗的促生作用，可推断2种木霉菌肥可以通过抑制病原菌生长、促进植物生长和提高马尾松自身的免疫能力进而降低尖孢镰孢菌对马尾松苗木的伤害。这与祁金玉等[34]报道的木霉可以通过对病原菌的直接抑制作用、诱导植物系统抗性等直接和间接的作用发挥樟子松对立枯病的抗病功能的结论相近。

综上所述，2种木霉菌肥对马尾松苗的生长、生理和养分吸收均表现出积极的作用；同时，添加2种木霉菌肥还能增强马尾松对立枯病的抗性。但是生物菌肥的施用方式、施用量、施肥时间与肥效的持效期关系还需要进一步研究，以期使生物菌肥能被大范围、大幅度地推广使用。