水溶性糖基铱配合物的合成、表征及成像分析

穆相君 冯青月 李梅金 易长青 付凤富

(1福州大学化学学院，食品安全与生物分析教育部重点实验室，福建省食品安全分析与检测技术重点实验室，福州 350116)

(2福州大学，能源与光催化国家重点实验室，福州 350116)

(3中山大学生物医学工程学院，广东省传感技术与生物医学仪器重点实验室，深圳 518107)

0 引言

近年来，具有d6电子结构的金属铱配合物由于其相对较长的激发态寿命、较高的发光量子产率以及极好的发光颜色可调控性而被广泛应用于光催化[1-2]、分子传感[3-4]、有机发光二极管材料[5-6]、细胞成像[7]以及光动力治疗[8-12]等领域。特别是在细胞成像方面，与传统荧光有机小分子相比，铱配合物具有较高的量子产率、较长的发光寿命、较大的斯托克斯位移和可调控的发射波长，从而降低了细胞自身荧光带来的干扰，因此受到了越来越多的关注。随着生物医学研究与应用发展的需要，这些材料近年来也被开发成为新型的生物医学影像材料、染色剂等。

细胞成像技术的发展对研究生物体的各项生理功能、疾病的发展机理和某些疾病的早期诊断具有重要的意义。开发一种细胞毒性低、发光效果好的细胞成像探针也成了一个热门的研究方向。然而金属铱配合物的水溶性普遍不好，使得其在生物研究方面的应用受到很大的限制。如何提高金属铱发光材料的水溶性，成为这类材料在生物医学上研究应用突破的关键点之一。目前常用的方法是通过在配体上修饰特定基团，使这类配合物的一些物理或化学性质发生改变，进而拓展这类发光材料在更多领域的应用。如在多吡啶骨架上修饰糖基可以达到降低毒性和提高水溶性的目的，同时使细胞或组织上键合糖基的分子成为标靶[13-14]。我们通过在联吡啶配体中引入多羟基的糖基合成了3种水溶性铱配合物(图1)，并对其进行了表征，进而研究其光物理性质及其在细胞成像中的应用。本研究对拓展功能金属配合物在生物分析领域中的应用有重要意义。

图1 水溶性金属铱配合物的化学结构Fig.1 Chemical structure of water-soluble iridium complexes

1 实验部分

1.1 实验仪器与试剂

所用仪器有ThermoFisherEvolution220紫外可见分光光度计、EdinburghFS5荧光光谱仪、FLS920稳态瞬态荧光光谱仪、BRUKERDPX300核磁共振谱仪、INNIGANMAT95型质谱仪和CARLOERBA1106型元素分析仪。

重铬酸钾、浓硫酸、硼氢化钠、乙二醇乙醚、碳酸钠、甲醇钠、氢溴酸等均为分析纯。有机溶剂均购自国药试剂有限公司。2，3-二氨基萘(99%)、1-苯基-1，2-丙二酮(98%)、2-(4-甲基苯基)吡啶购自梯希爱公司。1-硫代-β-D-葡萄糖四乙酸酯、无水氯化铱、2-(2，4-二氟苯基)吡啶(dfppy)购自Alfa Aesar。4，4′-二甲基-2，2′-联吡啶和2，2′-联吡啶购于百灵威化学试剂有限公司。

4，4′-二溴甲基-2，2′-联吡啶的合成按照文献[15]进行。4，4′-二(1-硫代-β-D-葡萄糖甲基)-2，2′-联吡啶(bpy-sugar)[16]、4-(2′-吡啶基)苯甲酸(tpy-COOH)[17]及2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉(mpbq)[18]根据文献合成。

1.2 配合物的合成

[(dfppy)2IrCl]2的合成：将0.3 g无水氯化铱(1.0 mmol)和 0.48 g(2.5 mmol)的 2-(2，4-二氟苯基)吡啶加入到6 mL的乙二醇乙醚和水的混合溶剂中(3∶1，V/V)，氮气保护下回流24 h。反应结束后，冷却至室温。过滤、收集得到黄色沉淀，分别用乙醇和丙酮洗涤沉淀，然后将沉淀溶解于二氯甲烷中，过滤除去固体，将滤液旋转蒸发除去溶剂，通过柱层析提纯，得产物0.3 g(产率50%)。

[(mpbq)2IrCl]2的合成：方法同[(dfppy)2IrCl]2的合成，用0.65 g(2.5 mmol)2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉代替2-(2，4-二氟苯基)吡啶，得红棕色产物0.15 g(产率49%)。

[(dfppy)2Ir(bpy-sugar)]Cl(1)的合成：将0.1 g[(dfppy)2IrCl]2(0.082 mmol)和0.1 g bpy-sugar(0.17 mmol)溶解于10 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(1∶1，V/V)，氮气下回流12 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂。固体用少量甲醇溶解，过滤得黄色溶液，旋转蒸发除去溶剂，再用甲醇溶解，这样反复3次得黄色固体0.116 g(产率61%)。1H NMR(400 MHz，MeOD)：δ 8.87(s，2H，H-bpy)，8.39(d，J=8.3 Hz，2H，H-py)，7.97(dd，J=18.3，6.6 Hz，4H，H-py)，7.70(dd，J=31.7，5.3 Hz，2H，H-py，2H，H-bpy)，7.22(s，2H，H-py)，6.71(t，J=10.4 Hz，2H，H-ph)，5.74(d，J=7.8 Hz，2H，H-ph)，4.63(s，2H，OH)，4.34～4.23(d，2H，OH),4.18(s，2H，OH)，4.03(d，J=14.3 Hz，2H，OH)，3.85(t，J=10.7 Hz，2H，CH—S)，3.73～3.47(m，4H，CH2—S)，3.37(s，2H，H6-suagr)，3.34(s，2H，H6′-sugar，overlap with solvent peaks)，3.25(s，8H，H2-sugar，H3-sugar，H4-sugar，H5-sugar)。ESI-MS(m/z)：C46H44F4IrN4O10S2([M-Cl]+)计算值1 145.204 1，实测值1 145.206 4。元素分析按 C46H44ClF4IrN4O10S2·H2O 的计算值(%)：C 46.09，H 3.87，N 4.67；实测值(%)：C 46.35，H 3.82，N 4.70。

[(tpy-COOH)2Ir(bpy-sugar)]Cl(2)的合成：采用类似于配合物1的方法制备配合物2，不同之处在于用tpy-COOH代替dfppy，并以二氯甲烷/甲醇为洗脱剂在硅胶上通过柱层析纯化得到产物。产物2为橙黄色固体(产率50%)。配合物经核磁共振波谱和质谱证实，与我们以前的文献报道一致[19]。

[(mpbq)2Ir(bpy-sugar)]Cl(3)的合成：用[(mpbq)2Ir-Cl]2代替[(dfppy)2IrCl]2，方法同配合物1的合成。将0.1 g[(mpbq)2IrCl]2(0.065 mmol)和0.1 g bpy-sugar(0.17 mmol)溶解于10 mL二氯甲烷和甲醇的混合溶剂中(1∶1，V/V)，氮气下回流12 h，冷却至室温，旋转蒸发除去溶剂。固体用少量甲醇溶解，过滤得红棕色溶液，旋转蒸发除去溶剂，再用甲醇溶解，这样反复3次得深棕色固体，柱层析纯化得0.085 g(产率49%)。1H NMR(400 MHz，MeOD)：δ 8.63(d，J=6.4 Hz，2H)，8.58～8.39(m，4H)，8.16(d，J=9.7 Hz，2H)，8.08～7.92(m，4H)，7.86(d，J=5.6 Hz，2H)，7.58～7.00(m，12H)，6.96～6.76(m，4H)，4.07(d，J=13.9 Hz，4H)，3.92(s，2H),3.87～3.52(m,8H)，3.56～3.50(m，2H)，3.51～3.36(m，6H)，3.15(dd，J=34.6，24.2 Hz，8H)。ESI-MS(m/z)：C62H58IrN6O10S2([M-Cl]+)计算值 1 303.332 8，实验值1 303.329 0。元素分析按C62H58ClIrN6O10S2·H2O 的计算值(%)：C 54.88，H 4.46，N 6.19；实验值(%)：C 55.09，H 4.41，N 6.22。

1.3 铱配合物的光物理性质测试

准确称量样品，配成浓度为0.1 mmol·L-1的水溶液，在紫外可见分光光度计上进行检测，稀释浓度至各吸收峰的吸收值约为1.0，根据比尔定律计算得到摩尔吸光系数。配合物1和2的紫外可见吸收光谱和发射光谱均在水中测定，配合物3在H2O/DMSO(39∶1，V/V)中测定。

发光绝对量子产率用积分球测得。配合物1和2分别在水中测定，配合物3在H2O/DMSO(39∶1，V/V)中测定。空白溶剂分别为水或H2O/DMSO(39∶1，V/V)。瞬态发光光谱在FLS920上测试(激发光源：氢气纳秒闪烁灯，激发波长400 nm)。

1.4 铱配合物的细胞成像及毒性研究

1.4.1 细胞的培养

用DMEM(A)细胞培养基(粉末型)培养宫颈癌细胞(HeLa)，用含10%胎小牛血清、1%青霉素和链霉素的培养液在湿润的CO2(体积分数5%)气氛中配成单个细胞悬液，以每孔1 000～10 000个细胞接种到96孔板，每孔体积200 μL，培养3 d。

1.4.2 细胞毒性研究

用MTT法来测试经铱配合物处理过的HeLa细胞活性。HeLa细胞用96孔组织培养板生长，密度是每孔4×106个，培养3 d。用铱配合物处理24 h后，培养板用培养液洗2次，然后加入MTT，在37℃下再培养4 h。随后，除去上清液并加入DMSO，用微孔板分光光度计测定570 nm处的吸光度，用未经铱配合物处理的细胞作为对照。相对细胞毒性(cell viability，CV)用公式 CV=(ODsample-ODblank)/(ODreference-ODblank)×100%(OD为光密度)计算。收集3次重复实验的数据，计算其标准偏差(SD)并用统计学的t-检验方法分析。当P值小于0.05时，该组数据才能被认为是位于有效的标准偏差范围内。实验中所用配合物为配合物1和2。

1.4.3 活细胞荧光成像研究

37 ℃下，HeLa细胞的培养基(1×105mL-1)在CO2(体积分数5%)气氛下于35 mm组织培养皿中培养并使其粘附24 h。用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤细胞，然后在37 ℃下单独与10 μmol·L-1铱配合物在DMSO/PBS(pH=7.4，1∶99，V/V)中培养 1 h，接着用DAPI(4，6-联脒-2-苯基吲哚)进一步染色15 h后，小心用PBS(pH=7.4)冲洗2～3遍，然后进行细胞成像。用Axio-LSM-700共聚焦荧光显微镜进行磷光成像拍摄并观察。

2 结果及讨论

2.1 铱配合物的合成表征

利用羟基糖联吡啶作为辅助配体，合成了3种铱（Ⅲ）配合物。合成过程包含2步：第一，通过Nonoyama反应进行双核环金属铱二氯体[Ir(C^N)2Cl]2的合成；第二，羟基糖联吡啶配体与二聚体[Ir(C^N)2Cl]2发生配位得到目标铱（Ⅲ）配合物。合成的目标配合物通过核磁共振氢谱、高分辨质谱和元素分析进行了表征，表征结果与目标配合物一致。

我们还通过傅里叶变换红外光谱对3个铱配合物进行了表征。从图2中可以看出，配合物1在3 155 cm-1处的振动峰对应为糖配体上的羟基伸缩振动，1 598 cm-1处的振动峰对应苯环上C=C伸缩振动，1 403 cm-1对应C—F的伸缩振动，但1 400 cm-1处还覆盖着糖上C—O的伸缩振动。在配合物2中，3 361 cm-1处的宽峰对应为羧基以及糖配体上的羟基伸缩振动共同作用，1 695 cm-1对应为羧基上C=O的伸缩振动，1 615 cm-1对应苯环上C=C伸缩振动，1 386 cm-1对应糖配体上C—O的伸缩振动。配合物3在3 393 cm-1处的峰对应为糖配体上的羟基伸缩振动，1 380 cm-1对应为糖配体上C—O的伸缩振动。由3个配合物对比可知配合物2明显多了一个C=O的伸缩振动吸收峰(1 695 cm-1)。与没有糖基的金属铱配合物相比[20]，这一类型的配合物在红外光谱3 100～3 400 cm-1处有一个非常明显的糖基上羟基振动的特征吸收峰。

图2 制备的金属铱配合物的红外吸收光谱图Fig.2 Infrared absorption spectra of as-prepared iridium（Ⅲ）complexes

2.2 铱配合物的光物理性质

2.2.1 铱配合物的紫外可见吸收光谱

含糖基的铱配合物能较好地溶于水，3种修饰有糖基的铱配合物在水中的光物理数据列在表1中，其在水中的紫外可见吸收光谱如图3a所示。参考相关报道[21]，配体上连接吸电子基团，能够有效地影响配体内电荷转移(ILCT)、金属到配体电荷跃迁(MLCT)以及配体到配体电荷跃迁(LLCT)，从而调节配合物的吸收和发射性质。从图3可以看出配合物1和2在215～320 nm处有强的吸收(摩尔吸光系数为104dm3·mol-1·cm-1数量级)，且配合物 1在约 355 nm处有相对较弱的吸收。根据环金属铱亚胺配合物的报道[22-23]，在215～320 nm处强的吸收可归属为配体的分子内跃迁(1IL)π-π*(N—N和N—C)，350～432 nm区域的次强的低能级吸收可归属于自旋允许的金属到配体的电荷跃迁(1MLCT)dπ(Ir)-π*(N—N)，这是环金属铱亚胺配合物的特征吸收。与配合物1和2对比，配合物3在465～510 nm有弱吸收。配合物3的环金属配体具有最大的共轭结构，其配体π*能级更低，因此金属到配体的MLCT吸收峰红移。实验结果表明通过选择不同的配体结构能调控配合物的最低激发态能级，因此配合物含有不同共轭程度的环金属配体的MLCT吸收峰不同。另外，新合成的铱配合物的吸收光谱在24 h内没有明显的变化，表明它们在水溶液中有很好的稳定性。

图3 糖基铱（Ⅲ）配合物的紫外可见吸收光谱图(a)和发射光谱图(b)Fig.3 UV-Vis absorption spectra(a)and emission spectra(b)of the glycosyl iridium（Ⅲ）complexes

表1 糖基铱（Ⅲ）配合物的光物理数据Table 1 Photophysical data of the glycosyl iridium（Ⅲ）complexes

2.2.2 铱配合物的发射光谱

在400 nm激发下含糖基的配合物1和2在除氧后的水溶液中有强烈的发光，配合物3则相对较弱，最大发射波长如图3b所示，分别为546 nm(1)、584 nm(2)、780 nm(3)。配合物1和2的发光波长与其他的环金属铱配合物类似，在可见光区540～580 nm发射出强的黄色光，而配合物3与大多数的环金属配合物不同，具有近红外光发射特征。参考文献中其他环金属铱配合物的发光光谱[24-28]，这些强的发射光谱可归因于自旋禁阻的金属到配体三重激发态电子转移(3MLCT)dπ(Ir)-π*(ligand,bpy-sugar)。另外，可能还混有自旋禁阻的配体内电子转移(3IL)(ππ*)。铱配合物有良好的发光颜色可调的性质，选择不同的配体或配体上修饰不同的基团，可改变铱配合物的发光波长。从表1中可以看出，选择不同共轭结构的环金属配体，配合物的发射波长不同：2-(2，4-二氟苯基)吡啶(dfppy)的金属配合物(1)最大发射波长546 nm，4-(2′-吡啶基)苯甲酸(tpy-COOH)的金属配合物(2)最大发射波长584 nm，2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉(mpbq)的金属配合物(3)最大发射波长780 nm，接近近红外区。这是由于羧基以及氟的吸电子作用，可以使得铱的dπ轨道更稳定，因此增大铱的dπ到配体bpy-sugar的π*轨道之间的能级间隔，使发射波长产生蓝移。同时2-甲基-3-苯基苯并[g]喹喔啉共轭离域大，降低了配体的π*，会导致减小铱到C^N配体的π*轨道之间的能级间隔，使得发光波长产生红移。合成得到的配合物具有不同的发射波长进一步说明了铱配合物良好的发光波长可调节性。同时我们也测试了铱配合物的发光量子产率(λex=436 nm)和寿命，数据列于表1。在未除氧的水溶液中配合物1有很高的发光量子产率，大概是经典三联吡啶钌的水溶液发光(φem=0.042)[29]的4倍，寿命为0.22 μs。相对来说，配合物2发光量子产率低很多，寿命也稍短，分别为3.1%和0.10 μs。而含有大共轭的环金属铱配合物3发光很弱，积分球无法获得准确的量子产率。但是其在近红外光区的发光特点使其有望作为近红外探针应用于生物分析，因为目前在近红外光区发光的金属铱配合物非常少。可以通过纳米材料或聚合物包埋等方法提高3的发光效率。

2.3 铱配合物的毒性研究及细胞成像

通过MTT法测定制备的铱配合物培养过的HeLa细胞活性可以得到这些铱配合物对细胞活性的影响，该方法采用配合物1和2的DMSO/PBS(1∶99，V/V，pH=7.4)混合溶液分别对HeLa细胞培养24 h。

如图4细胞所示，当浓度低于100 μmol·L-1的配合物1和2培养细胞24 h后，大约有大于70%的HeLa依然存活，这表明这些配合物的细胞毒性在可接受的范围内。对比一些其他的金属配合物的细胞毒性试验，制备的2个配合物在如此大的浓度下，细胞却还能有如此高的活性，说明羟基糖配体对于降低这类金属配合物的细胞毒性是有所帮助的，这为提高这类配合物在生物上的研究奠定了基础。

图4 配合物1和2培养下的HeLa细胞活性Fig.4 HeLa cell viability cultured with complexes 1 and 2

细胞吸收是探针能否成功的关键[30-31]。HeLa细胞被培养在 10 μmol·L-1的铱配合物溶液中 1 h，多余的染料用缓冲溶液冲洗干净，共聚焦成像如图5所示。从图上可看出，金属铱配合物能够穿过细胞膜，进入到细胞，且与DAPI染色的细胞核部分有所重合，说明铱配合物进入到了细胞核。同时配合物的发光情况良好，说明在细胞所在的生物环境中，配合物仍是稳定的。而在细胞质中也观察到配合物的存在，说明这2个铱配合物对于细胞器定位的专属能力还不够，未见明显定位。与未修饰F或者COOH的糖基金属铱配合物[32]相比，这2个配合物都能穿过细胞膜，表明F或者COOH基团在提高糖基金属铱配合物的细胞穿透性方面有重要作用，具体的进入方式还有待进一步研究。通过修饰糖基配体，增大铱配合物的水溶性，并使得其能进入细胞内部，这为金属铱配合物作为生物探针奠定了重要的基础。

图5 HeLa细胞在配合物溶液中培养后的染色与共聚焦成像照片Fig.5 Staining and confocal imaging photos of HeLa cells cultured in the solution of complex

3 结论

合成了3种新型的水溶性铱配合物，通过核磁共振氢谱、质谱、红外光谱和元素分析对铱配合物进行了表征，结果与目标配合物一致，之后用发光成像等手段研究了其在生物研究方向的应用。利用紫外可见吸收光谱和发光光谱研究了其光物理性质。通过选择羟基糖配体，以及引入一些吸电子基团，有效地调节了铱配合物的光物理性质和水溶性。水溶性的提高，有利于铱配合物在生物分析上应用的前景。通过细胞实验研究发现，羟基糖配体的引入很好地降低了铱配合物的细胞毒性；而羧基或者氟基团的引入不但调控了配合物的发光波长，还提高了分子的细胞穿透性，使得发光金属铱配合物作为细胞探针成为可能。