miRNA let-7a在卵巢癌中的研究进展

全丽妮 综述 黄守国 审校

中南大学湘雅医学院附属海口医院妇产科，海南 海口 570208

卵巢癌(ovarian cancer，OC)因其发病隐匿、缺乏早期诊断方法，致使多数患者就诊时已是疾病中晚期，五年生存率低于45%，使之成为女性第七大最常见的肿瘤及妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因之一[1]。目前发现绝大多数的人类基因组将被转录成非编码RNA，这种RNA 不具备明显蛋白质编码能力，再根据其大小是否超过200 个核苷酸分为长链非编码RNA和小非编码RNA[2]。其中miRNA 作为小非编码RNA的一种，普遍存在于真核生物体内，单个miRNA 可以通过同时靶向调控多个mRNA基因，影响其转录后活性在细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学功能中发挥重要作用[3]。而异常表达的miRNA 通过解除对癌基因或抑癌基因的调控，与肿瘤的发生、发展以及化疗耐药等密切相关[4-5]。同时也说明miRNA可以作为恶性肿瘤早期诊断标志、治疗以及评价预后的一种手段的潜力。现就miRNA let-7a在卵巢癌领域的研究进展进行综述。

1 miRNA let-7a的概述

miRNA let-7 最早是在秀丽隐杆线虫中被发现，是第二个被发现的miRNA，也是线虫从幼虫到成虫形态转变的关键调控因子。miRNA let-7家族由10个成熟的亚型组成，而let-7a 是这个家族中重要的成员之一。它们最初在发夹环中以pri-miRNA 的形式表达，碱基由RNase Ⅱ酶Drosha 剪切，形成前miRNA(pre-miRNA)。然后，前miRNA 从细胞核转移到细胞质，并在细胞质中被另一种RNaseⅡ酶Dicer 与TRBP(the HIV-1 TAR RNA binding protein)合作将其环状区域切割，形成成熟的miRNA。成熟的miRNA 又被整合到RNA 诱导沉默复合物(RNA inducing silencing complex，RISC)中，通过与mRNA的3’端非翻译区特异性结合致使其翻译终止，从而在转录后水平调控基因表达，进而参与细胞分化、增殖、凋亡、个体发育、机体代谢以及病毒感染等过程[6-8]，是多种恶性肿瘤发生发展的重要调控因子，如结肠癌、乳头状甲状腺癌、骨肉瘤、胰腺癌等，推测其与肿瘤的发生发展关系密切[9-11]。探讨miRNA let-7a 在卵巢癌的发生发展中的作用机制，对实现卵巢癌早发现、早诊断、早治疗及预后评估过程中寻找新的分子靶标有着重要意义[12-13]。

2 miRNA let-7a在卵巢癌中的表达及其与卵巢癌的早期诊断

近年来随着基因芯片技术的发展，差异表达的miRNA在肿瘤研究中被广泛应用。可以通过miRNA的差异表达谱对正常组织与肿瘤组织进行区分。并且miRNA广泛存在于人类及其他哺乳动物的血液、尿液及其他体液中，并在血清中稳定性较高，不易被内源性RNA酶降解。而肿瘤组织中差异表达的miRNA也能类似地反映在患者的血液中。因此，检验肿瘤患者血液中miRNA 的表达情况可以作为一种侵入性诊断指标为肿瘤的诊断提供一定的依据。

通过应用微阵列等方法对卵巢上皮性癌和正常卵巢组织进行miRNA 筛查，发现miRNA let-7a 在卵巢上皮性肿瘤中表达下调[14]。对卵巢癌患者血浆中的miRNA let-7a 表达水平进行研究，进一步证实了miRNA let-7a 在卵巢癌组织中呈现低表达，并且通过ROC 曲线与Ca125 进行比较，结果表明miRNA let-7a对卵巢癌具有较高的诊断价值，可以作为辅助诊断卵巢癌的指标[15]。但由于miRNA let-7a并不是卵巢癌的特有标志，其作为卵巢癌诊断的标志物仍然需要结合其他肿瘤标志物和临床资料，因此不能单独用于卵巢癌的诊断，但可以利用它来提高诊断的灵敏度和特异度，为卵巢癌的早期诊断作出一定贡献。

3 miRNA let-7a与卵巢癌的发生发展

miRNA let-7a 已被发现与多种肿瘤类型相关，是肿瘤发生、发展的重要调控因子[16-18]。但miRNA let-7a在人类肿瘤中具体发挥何种作用，目前存在两种观点：多数研究表明miRNA let-7a在人类肿瘤中呈现低表达，发挥抑癌作用，如乳头状甲状腺癌、结肠癌[9-10]等。但也有报道称miRNA let-7a 在某些肿瘤中可作为癌基因发挥作用[9]。而在卵巢癌中，miRNA-let7a呈现低表达，发挥抑癌作用。但其在卵巢癌中的抑癌作用机制，目前报道较少[12，19]。

细胞自噬是细胞在缺血/缺氧的条件下自我吞噬内部成分的细胞学现象，是一个细胞清除系统。适度的自噬能让细胞获得生命必须物质，介导细胞逃避不良生活环境[20]。在肿瘤的发展中，自噬发挥着双刃剑的作用：一方面通过介导损伤修复机制抑制肿瘤的形成；另一方面，通过自噬介导的大分子回收帮助肿瘤细胞抵抗外部压力，并为肿瘤的生存提供能量和原料[21]。为了探讨在缺氧条件下卵巢癌细胞miRNA let-7a 的表达情况及其对缺氧细胞自噬/增殖的影响，有学者通过构建缺氧模型，对卵巢癌HO-8910细胞进行miRNA let-7a-mimics 转染、自噬细胞测定、检测细胞增殖及相关蛋白表达情况等一系列实验[22]。结果显示在缺氧状态下，卵巢癌细胞中的miRNA let-7a呈低表达，并且细胞在经过缺氧处理后自噬水平显著升高，细胞增殖轻度抑制；当上调miRNA let-7a 表达水平后，细胞自噬明显减弱，细胞增殖受到明显抑制。而这种变化关系与自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ等的表达相符，可以初步证明miRNA let-7a与细胞自噬有着密切的调控关系，也可初步推断卵巢癌细胞在缺氧状态下可通过调控miRNA let-7a 的表达启动细胞自噬保护作用介导细胞逃避缺氧环境，利于肿瘤细胞的增殖。为了更进一步了解miRNA let-7a 与细胞自噬在卵巢癌细胞中的关系，最近有学者研究发现Beclin1 依赖/不依赖的自噬能够增加卵巢癌细胞miRNAlet-7a-3p 的表达，但在miRNAlet-7a-3p模型中自噬标志物如LC3B-Ⅱ的表达并没有明显增加，而下调miRNAlet-7a-3p 也没有显著影响细胞自噬，这表明miRNAlet-7a-3p 可能是自噬的下游效应信号，且对自噬没有明显的反馈效应[23]。该研究结果显示Beclin1依赖/不依赖的自噬通过下调泛素结合蛋白SQSTM1/p62使miRNA加工酶Dicer1和miRNA效应剂AGO2减少，进而增加miRNAlet-7a-3p 的表达最终抑制卵巢癌细胞迁移。关于miRNA let-7a 在自噬中的作用，FAN等[24]通过对Western blotting以及免疫印迹法确定上调表达的miRNAlet-7a 可以增强胃癌细胞的自噬水平，而抑制miRNAlet-7a 的表达将导致细胞自噬活力降低，此后通过生物信息学数据分析以及一系列研究证实在胃癌细胞中，miRNAlet-7a 通过靶向Rictor 调控Akt-mTOR信号通路进而调控细胞自噬。这一结果与LIAO等[23]的研究略有出入，但miRNAlet-7a在细胞自噬中到底是上游调控信号还是下游效应分子，还需要进一步研究。

高迁移率族蛋白2(the high-mobility group AT-hook protein gene，HMGA2)参与细胞分化、胚胎发育以及肿瘤转化等多种生物过程[25]，且在三大数据库(TargetScan、miRanda、PicTar)中均被预测为miRNAlet-7a的潜在靶点。MiRNAlet-7a 与HMGA2 的直接调控关系已经在肺癌[26]、乳腺癌[27]、食管癌[28]以及鼻咽癌[25]等中得到证实，但都是从信号通路水平进行探讨。在卵巢癌中，国外学者从基因失衡的角度研究基因失衡对miRNA let-7a 在卵巢癌中的影响，结果发现在基因组异常的样本中，76%的样本存在至少一个染色体畸变，导致miRNA let-7a基因簇的缺失，使miRNA let-7a在卵巢癌中低表达，从而导致miRNA let-7a 对HMGA2调控解除而高表达，促进卵巢癌的发生发展[29]。并且miRNA let-7a基因簇缺失主要发生在位于22q13.31上的MIRLET7A3，且这种缺失不论在良性还是恶性卵巢肿瘤中均存在。更进一步强调miRNA let-7a 基因簇的缺失在卵巢癌发生发展中的重要性。

4 miRNA let-7a与卵巢癌的化疗耐药

目前，卵巢癌的标准治疗方法为减瘤手术及后续以铂类及紫杉醇为基础的联合化疗，虽然取得了一定的成果，但疾病结局依然令人失望，许多患者因疾病复发而死亡[30]。而肿瘤对化疗药物产生耐药性是影响肿瘤疗效的重要阻碍因素之一，miRNAs 在其中发挥重要作用。有报道表明，过表达的miRNAlet-7a 可使体外培养的耐药乳腺癌细胞对表阿霉素敏感[31]。研究发现在体外和体内实验中miRNAlet-7a对胰腺癌细胞的增殖、转移和吉西他滨药物敏感性均有抑制作用[8]。

而miRNA let-7a 在卵巢癌化疗敏感性/耐药性中发挥何种作用呢？有研究对178例接受铂化疗并接受紫杉醇化疗和只接受铂化疗而不使用紫杉醇的卵巢癌患者的肿瘤组织中的miRNA let-7a 进行qPCR 检测，并进行生存分析，发现对铂类及紫杉醇联合化疗敏感的患者miRNAlet-7a的表达水平明显低于对化疗不敏感的患者。生存分析结果显示：当患者只接受铂类化疗时，高表达miRNA let-7a的患者生存期优于低表达患者；而当患者接受铂类+紫杉醇联合化疗时，结果完全相反，miRNA let-7a 高表达患者的无进展期和整体生存期较miRNAlet-7a低表达者短[32]。同一实验进一步研究，发现miRNA let-7a 低表达患者中，接受联合化疗的患者生存期比单一接受铂类化疗的患者更好；而在高表达miRNA let-7a 患者中，不同的化疗方案对生存期影响不大。这一结果表明卵巢癌患者miRNAlet-7a 的表达可能干扰化疗疗效，可以通过检测患者miRNAlet-7a 的表达选择更好的化疗方案，为临床治疗提供新思路[32]：当患者被检测出miRNA let-7a 低表达时，选择铂类+紫杉醇联合化疗；而当患者miRNA let-7a 相对高表达时则选择铂类单一化疗。但这一思路是否能得以实现，以及在这一思路指导下的化疗方案选择的miRNA let-7a 的表达水平如何量化？怎么界定？这是一个值得思考的问题，需要更进一步研究探讨。

趋化因子受体4 (CXC chemokine receptor 4，CXCR4)在多种肿瘤细胞中高表达，并被发现其与miRNA let-7a 间可能存在靶向调节关系，并通过调控miRNA let-7a 的表达影响肿瘤细胞(如急性髓细胞白血病、鼻咽癌等)的化疗耐药性，但这一作用在卵巢癌中鲜有报道[8，33]。最近有学者研究发现在卵巢癌中，高表达的CXCR4 抑制miRNA let-7a 的表达进而促进凋亡抑制基因BCL-XL 的表达，最终导致卵巢癌细胞SKOV3 及Caov3 对顺铂耐药性增强[12]。这是首次在卵巢癌中探讨CXCR4 对miRNA let-7a的调控作用，以及它们对卵巢癌细胞顺铂耐药性的影响。

5 miRNA let-7a与卵巢癌的预后

为了更深入的研究miRNA let-7a 与卵巢癌化疗敏感性及预后的关系，有学者采用定量逆转录聚合酶链反应(PCR)技术对211 例卵巢上皮性癌组织中的Lin-28b/miRNA let-7a 和IGF-ⅡmRNA 进行分析，并进行分类和回归树分析(cart)及生存分析，结果发现在上皮性卵巢癌中，所有高表达Lin-2b 的患者和Lin-28b低表达或miRNA let-7a及IGF-Ⅱ高表达的患者复发风险及总体死亡率均高于其他患者；而Lin-28b 和miRNA let-7a 均低表达的患者对化疗反应较好。这些结果表明，Lin-28b/let-7a/IGF-Ⅱ轴的分子亚型与异质性进展相关，可能对预测上皮性卵巢癌有临床意义[34]。

人肿瘤睾丸抗体(HIWⅠ)又被称为PIWI样蛋白1(piwi-like ran-mediated gene silencing 1，PIWIL1)，是argonaute 蛋白家族成员，在人体组织中广泛表达，与人干细胞自我更新、RNA 干扰密切相关，并影响肿瘤的增殖和预后[35]。通过对HIWⅠ免疫共沉淀测序，结果表明HIWⅠ与miRNA let-7a相互作用，调控基因表达[36]。因此，为探讨miRNA let-7a 与HIWⅠ在评估上皮性卵巢癌预后的作用意义，采集211 例上皮性卵巢癌患者的肿瘤组织，对肿瘤组织中的HIW Ⅰ及miRNAlet-7a的表达及其与卵巢癌预后的关系进行研究，结果发现在miRNA let-7a 高表达的患者中，中度表达HIWⅠ的患者较较低或较高表达HIWⅠ的患者，其死亡风险明显增加，调整后的HR 为2.62 (95%CI：1.30～5.30)。而那些低表达miRNA let-7a 的患者中的死亡风险与HIWⅠ的表达无明显相关性，调整后HR为1.63 (95%CI：0.86～3.08)。表明HIWⅠ和miRNA let-7a的表达对卵巢上皮性癌的总体生存期也有协同作用，HIWⅠ和miRNA let-7a可能对上皮性卵巢癌的预后有临床意义[37]。

6 展望

随着miRNA与卵巢癌相关性研究的不断深入，越来越多的miRNA被人们所熟知，同时其下游靶基因或靶点以及上游调控基因也在不断被发现，旨在探索miRNA 与肿瘤发生、发展的分子机制，以便在肿瘤的早期诊断、治疗及后续的预后评估发挥重要作用。

竞争性内源RNA(ceRNA)并不是新的RNA，而是一种新的基因表达调控模式，首先由POLISENO 等[38]提出这一概念。在ceRNA 理论假说中，RNA 只要拥有miRNA 反应元件(miRNA response element，MRE)结构都可以成为ceRNA，包括circRNA、lncRNA、mRNA 以及假基因转录物等，且ceRNA 可以通过与miRNA竞争性结合来调控基因表达，进而影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及化疗敏感性/耐药性[39]。那么miRNA let-7a在卵巢癌的发生、发展中所发挥的作用是否也受到ceRNA 的调控呢？目前关于这一问题鲜有研究。因此，对miRNAlet-7a 及可能涉及的ceRNA 机制在卵巢癌中的具体作用机制及化疗敏感/耐药机制进行深入研究，将为卵巢癌的生物学行为发生机制积累更多的分子理论基础，为卵巢癌的诊断和预后评价提供新的分子标志物，为卵巢癌的治疗方案选择提供新的思路。