榄香烯乳联合化疗对Lewis肺癌的影响及机制

范瑞娟 王 瑾 郭醒爽 杨 敏

近年来，肺癌的发病率和死亡率在全球范围内呈现出加速增长的趋势，临床预后较差，5年总生存率低于15%[1]。肺癌的临床治疗仍以化疗为基础，但化疗药物的副作用限制了其临床应用。中西医结合可以达到降低毒性，提高效率的目的[2]。近年来，临床肿瘤的治疗越来越受到关注，特别是在改善症状，提高生活质量方面。榄香烯是从姜科温莪术挥发油中提取的抗癌活性成分，主要活性成分是β-榄香烯，其在临床使用中乳化以获得榄香烯乳剂注射剂[3]。榄香烯的抗癌生物活性主要是抑制肿瘤细胞的有丝分裂过程，诱导肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长，并且具有较轻微的不良反应[4]。本次研究选取近交系C57BL/6小鼠40只，探讨榄香烯乳联合化疗对Lewis肺癌的影响及机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选取近交系C57BL/6小鼠40只，雌雄各半，体质量18～22 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司。适应性喂养1周，人工光照明暗各12 h，温度20 ℃～24 ℃，湿度50%～60%，自由饮水和摄食。

1.2 实验方法

1.2.1 Lewis肺癌小鼠模型建立 将Lewis肺癌细胞复苏，并向RPMI-1640培养基中加入100 ml/L胎牛血清用于常规细胞培养传代。在对数生长期，在无菌条件下将Lewis肺癌细胞悬浮液(2×106/ml)接种到2只C57BL小鼠的右腋皮下。接种14天后，通过脱臼处死2只C57BL荷瘤的小鼠，在无菌条件下取出肿瘤组织，根据肿瘤质量(g)与生理盐水(ml)1∶3的比例制备肿瘤组织匀浆。将肿瘤组织匀浆(0.2 ml/只)接种另外38只C57BL小鼠，体重16～20 g，建立Lewis肺癌小鼠模型。

1.2.2 分组及给药 随机分为模型组、榄香烯乳组、化疗组和联合组，其中榄香烯乳组腹腔注射100 mg/kg/d榄香烯乳，化疗组腹腔注射3 mg/kg/d足叶乙甙和3 mg/kg/d顺铂，联合组腹腔注射100 mg/kg/d榄香烯乳、3 mg/kg/d足叶乙甙和3 mg/kg/d顺铂，连续7 d。

1.2.3 瘤体、脾脏及胸腺测量 取出小鼠脾脏和胸腺并称重，并计算器官指数。用游标卡尺(精确到0.1 mm)每天在同一时间测量肿瘤最长直径(a)和最短直径(b)，并计算肿瘤体积(V)：V=ab2/2。

1.2.4 肺转移灶检测 各组小鼠肺组织用100 g/l多聚甲醛固定，解剖显微镜检查肺转移结节数。抑制率为(肺癌模型组中转移的平均数-实验组中转移的平均数)×100%/肺癌模型组平均转移次数。

1.2.5 血清VEGF检测 通过人VEGF ELISA试剂盒检测上清液中VEGF的浓度。根据试剂盒的说明进行，并通过酶标仪选择492 nm的波长测定。

1.2.6 Western blot检测 研磨肿瘤组织，并用组织蛋白提取试剂常规提取蛋白质。从每组中取出4 μl蛋白质样品，并通过BCA方法定量蛋白质以调节蛋白质浓度。将蛋白质样品与等体积的2×SDS缓冲液混合，加热变性，通过SDS-PAGE电泳分离上清液，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜洗涤并在5%牛血清白蛋白溶液中在室温下封闭1 h。洗涤后，将膜置于一抗稀释液(兔抗小鼠Per2或SIRT1一抗溶液1∶100)中，并在4 ℃温育过夜。第2天早上洗膜后，将其转移至二抗稀释液(碱性磷酸盐标记的山羊抗兔IgG溶液1∶1000)，在室温下孵育2 h，显影。在出现明显条带后终止反应，最后使用GIS-2020数字图像分析系统扫描并分析蛋白质杂交条带。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠瘤重、肺转移结节数比较

榄香烯乳组、化疗组和联合组瘤重和肺转移结节数均较模型组降低(P<0.05)，其中联合组瘤重和肺转移结节数明显低于榄香烯乳组、化疗组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠瘤重、肺转移结节数比较

2.2 各组小鼠免疫器官脏器指数比较

联合组脾脏指数和胸腺指数明显高于化疗组和模型组(P<0.05)，但低于榄香烯乳组(P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠免疫器官脏器指数比较

2.3 各组小鼠血清VEGF水平比较

模型组、榄香烯乳组、化疗组和联合组血清VEGF分别为(112.24±15.54)pg/ml、(96.46±17.80)pg/ml、(84.03±16.61)pg/ml、(66.72±19.12)pg/ml，榄香烯乳组、化疗组和联合组血清VEGF均较模型组降低(P<0.05)，其中联合组血清VEGF明显低于榄香烯乳组、化疗组(P<0.05)。

2.4 各组小鼠肿瘤组织Per2、SIRT1蛋白表达比较

联合组肿瘤组织Per2和SIRT1蛋白相对表达量明显高于榄香烯乳组、化疗组和模型组(P<0.05)。见表3、图1。

表3 各组小鼠肿瘤组织Per2、SIRT1蛋白表达比较

A为模型组；B为榄香烯乳组；C为化疗组；D为联合组。

3 讨论

肺癌是临床预后不良的恶性肿瘤之一，化疗在治疗中占主导地位，但化疗药物会引起较强的不良反应，其临床应用因此受限[1]。因此，寻找具有良好抗癌作用和小副作用的药物是癌症研究领域的重要方向。中医药在肺癌防治中的作用逐渐受到重视，在缓解症状，延长生存期，提高治疗依从性，减轻和增加疗效，抵抗转移和复发方面具有明显的优势[4]。足叶乙甙是细胞周期特异性的抗肿瘤药物，作用于DNA拓扑异构酶Ⅱ靶点，形成稳定的可逆复合物，可阻断DNA修复过程，是主要的癌症化疗药物；顺铂主要作用位点是DNA的嘌呤和嘧啶碱基，使癌细胞的DNA复制过程受到抑制，破坏细胞膜结构，具有抗癌谱广，作用强的特点，可以和与各种抗肿瘤药物协同作用，无交叉耐药的特点[5]。

由足叶乙甙和顺铂组成的EP方案是用于治疗小细胞肺癌的标准化疗方案，可以有效并广泛用于临床实践。然而，临床资料显示，足叶乙甙有更严重的不良反应，如严重的骨髓抑制、胃肠道反应和肝肾损害等；顺铂的肾毒性和胃肠道反应也很严重[6]。榄香烯具有副作用小，耐受性好，可提高治疗依从性，并可与化疗药物联合使用，达到降低毒性和提高疗效的效果[7]。本次研究中，各组小鼠瘤重、肺转移结节数进行比较，榄香烯乳组、化疗组和联合组瘤重和肺转移结节数均较模型组降低，其中联合组瘤重和肺转移结节数明显低于榄香烯乳组、化疗组。说明榄香烯乳联合足叶乙甙与顺铂化疗方案可以显著抑制肺癌小鼠肿瘤组织的生长过程，抑制癌细胞的转移和复发。各组小鼠免疫器官脏器指数比较，联合组脾脏指数和胸腺指数明显高于化疗组和模型组，但低于榄香烯乳组，这表明单独化疗可导致肺癌小鼠脾脏和胸腺萎缩，联合使用药物可显著提高肺癌小鼠的脾指数和胸腺指数，说明榄香烯乳可以在进入人体后保护人体的免疫器官，增强机体的自身免疫功能，从而发挥其降低毒性和提高效率的抗肿瘤作用。

血管内皮生长因子(VEGF)的生物学功能主要是刺激内皮细胞的增殖、促进血管生成和增加微小血管的通透性，可以为肿瘤细胞的生长和血管网络的建立提供营养物质[8]。VEGF在肿瘤组织中的表达水平与肿瘤微血管密度，恶性程度和转移程度具有高度的正相关，与患者预后呈负相关[9]。VEGF与其受体结合后，促进肺血管内皮细胞的增殖和迁移，促进血管的形成和生长，加速基底膜的降解，增强血管通透性，促进肺癌的发展[10]。本次研究中，榄香烯乳组、化疗组和联合组血清VEGF均较模型组降低，其中联合组血清VEGF明显低于榄香烯乳组、化疗组，表明榄香烯乳剂可抑制肺癌VEGF的分泌，降低血液中的浓度，减弱其对受体的影响，减缓肿瘤组织中血管内皮细胞的增殖，将榄香烯乳剂与化疗联合对VEGF的分泌抑制作用更强，表明两者之间存在协同作用。

生物钟是由身体自我产生的时间节律，不受外部因素的控制，与衰老、代谢紊乱和肿瘤形成密切相关[11]。生物体通过最近的节律调节肿瘤相关基因的表达，并且生物钟基因的异常表达可能引起节律紊乱，导致肿瘤形成的风险增加[12]。Per2基因是最近节律系统的重要成员，参与调节细胞周期和新陈代谢的多种信号通路。淋巴瘤和白血病组织中Per2蛋白的表达水平显著低于正常组织，诱导Per2高表达后，肿瘤细胞表现出细胞周期停滞，增殖能力下降和细胞凋亡加速。这些结果表明Per2基因可以抑制肿瘤生长；哺乳动物SIRT1基因是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸依赖性组蛋白3脱乙酰酶，其与酵母染色质沉默因子2最同源，并具有调节生物代谢的功能[13]。SIRT1可通过去乙酰化与Per2相互作用，在激活SIRT1后，Per2可以发生去乙酰化，并且乙酰化的Per2可以通过磷酸化降解[14]。研究发现SIRT1在肿瘤形成过程中具有致癌和抑癌基因功能，其关键作用是维持致癌基因和抑癌基因之间的平衡[15]。

本次研究中，各组小鼠肿瘤组织Per2、SIRT1蛋白表达比较，联合组肿瘤组织Per2和SIRT1蛋白相对表达量明显高于榄香烯乳组、化疗组和模型组。推测榄香烯乳抑制 Lewis 肺癌小鼠肿瘤生长的作用机制可能与生物钟基因 Per2和SIRT1的表达被激活有关，且榄香烯乳联合化疗更能促进肿瘤组织中 Per2 和 SIRT1 蛋白的表达，在临床上治疗肺癌的效果可能会更好。

综上所述，榄香烯乳联合化疗对Lewis肺癌有较好的抑瘤作用，可能与免疫调节、VEGF下调，促进Per2/SIRT1蛋白表达有关。