大蓟金属含量测定和地上部分总黄酮性能探究

杨 芬

(曲靖师范学院 化学与环境科学学院，云南 曲靖 655011)

0 引 言

中药的有效成分主要是黄酮、生物碱、氨基酸和多糖等，另外还含有一些金属元素，随着人们对中药需求的逐渐增加，研究中药时不仅重视有机成分的研究，也开始重视金属元素的测定，以期为中药的鉴定和改进提供依据[1].大蓟为菊科蓟族蓟属多年生草本植物，生长于路旁、草地、山坡，性凉，味甘，微苦，有凉血止血的功效[2].研究表明，大蓟中金属元素对一些疾病能起到防治作用[3].

黄酮类化合物(flavonoids)是植物界分布较广泛的一大类天然酚性化合物，几乎每种植物体内都有黄酮类化合物[4].由于黄酮类化合物繁多的生物活性和低毒性，已成为当前国内外食品开发研究中的一个热点[5].黄酮类化合物大多有较强的自由基清除功能，因此黄酮类化合物具有很好的应用前景[6].本研究对大蓟根和地上部分金属元素含量进行测定，并选择同为黄酮的芦丁作为阳性比对，对大蓟地上部分总黄酮的抗氧化活性进行研究，以期为深入研究和开发利用大蓟提供一定的理论依据.

1 实验部分

1.1 实验材料

试剂：大蓟(采自曲靖师范学院周边田间地头)分为地根和地上部分两部分，经洗净、烘干、粉碎后密封备用；芦丁(生化试剂BR)，国药集团化学试剂有限公司；九水硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇均为分析纯.

1.2 实验仪器

UV-2550紫外分光光度计(岛津企业管理(中国)有限公司SHIMADZU CORPORATION)；HC-3518高速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；CP214电子天平(奥豪斯仪器有限公司).

2 实验方法

2.1 大蓟中金属含量的测定

(1)试液的制备.分别称取大蓟的根粉末和地上部分粉末2.0g于50mL烧杯中，加硝酸-高氯酸40mL(体积比5∶1)加热浓缩至5mL时趁热过滤，滤液转入100mL容量瓶中，定容至刻度.每个样品均平行做两份.

(2)标准曲线制作.分别吸取体积为0mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL钾(K)、钙(Ca)、钠(Na)、锌(Zn)、铜(Cu)和锰(Mn)标准操作液(5μg/mL)于6个100mL容量瓶中，用5%HNO3溶液(体积分数)定容、摇匀.此标准系列分别含以上6种元素0μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.3μg/mL、0.4μg/mL和0.5μg/mL.仪器自动绘制标准曲线.

(3)样液的测定.测定样液吸光度，并在标准曲线上查得各金属元素的浓度，计算各金属元素的含量.大蓟粉末中金属含量结果用mg/kg表示：

含量(mg/kg)=c1V/m

式中：c1-从标准曲线上查得元素的质量浓度(单位：μg/mL)；m-称量试样质量(单位：g)；V-样液的总体积(单位：mL).

2.2 超声法提取大蓟中总黄酮及抗氧化活性

2.2.1 大蓟实验材料

将新鲜采集大蓟清洗干净，将根和地上部分分开，置于60℃烘箱中直至烘干，后经粉碎，过筛，制得地根和地上部分干燥粉末样品备用.

2.2.2 大蓟粉末总黄酮的提取

准确称取地根和地上部分粉末1.0000g于三个100mL烧杯中，各加入50%、75%和100%的乙醇溶液30mL后静置5分钟，在40℃的温水中用超声波萃取20min，重复两次，合并提取液静置12h，离心后取上层清液即为试样液体.

2.2.3 最大波长的确定

在10mL容量瓶中加2mL试样，用3mL无水C2H5OH溶液和0.6mL5%的NaNO2溶液溶解，静置8min后加入0.6mL10%的Al(NO3)3溶液和3mL8.6%NaOH溶液，混匀后用50%C2H5OH溶液定容至10mL，400.00～600.00nm的范围扫描，在502.00nm处有最大吸收[7].

2.2.4 芦丁标准曲线的建立

准确称取干燥恒重芦丁0.0122g，加50%CH3OH溶液定容到50mL即得到质量浓度为0.2440mg/mL芦丁标准溶液.按照参考文献[8-9]操作即为标准曲线.

2.2.5 总黄酮溶液的制备

分别称取100.0g大蓟根粉末和地上部分粉末加入700mL的75%的C2H5OH溶液静置过夜，取上层清液.将所得溶液过硅胶柱，再用75%的乙醇溶液作为洗脱剂来收集总黄酮，将回收的乙醇上聚酰胺柱，先用水作为洗脱液去除糖类化合物，待柱子中的流出的液体为无色时，改用无水乙醇为洗脱液，待流出液显颜色时收集即为待测总黄酮溶液.

2.2.6 总黄酮含量的测定

在10mL的容量瓶中加入0.2mL待测总黄酮溶液，75%的C2H5OH溶液定容且作为空白试样.取0.2mL样品-C2H5OH溶液，先加0.6mL5%的NaNO2溶液，再加0.6mL10%Al(NO3)3，最后加入3mL8.6%的NaOH溶液，用50%的C2H5OH溶液定容到10mL，502nm波长处进行吸光度测定，用标准曲线回归方程测定样液中总黄酮相当于芦丁的含量.

2.2.7 总黄酮抗氧化活性实验

(1)配制与标准芦丁溶液浓度相同的总黄酮溶液.取65mL质量浓度为0.00755mg/mL总黄酮溶液加到100mL容量瓶中，无水C2H5OH溶液定容至刻度即可得到与质量浓度为0.2440mg/mL芦丁对照样相同实验样液[8-9].

(2)还原能力的测定.在6支25mL的比色管中加入0.0mL、0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL和0.5mL总黄酮实验样液，均用水稀释到0.5mL.选择不加KSCN的作为对应空白样(共6份).分别加入5mL的0.2mol/L的H3PO4缓冲液(H=6.6)和2.5mL1%的KSCN[8]，50℃水浴反应20min后冷却，加入2.5mL10%的Cl3CCOOH溶液，使其放置澄清.取清液2.5mL于试管中，加入2.5mL蒸馏水，再加0.5mL0.1%的FeCl3溶液，混合搅拌均匀，使其放置反应10min，在700nm处测定吸光度值[10-11].质量浓度0.2440mg/mL的对照样芦丁，实验方法同上，参见参考文献[8，12].

(3)羟基自由基清除能力的测定[8-9].取0.1mL、0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL和0.6mL总黄酮实验样液加到25mL的比色管中[7-8]，再加入2mLFeSO4溶液和2mLH2O2溶液(浓度均为6mmol/L)，放置后加入6mmol/L的n-OH-PhCOOH-C2H5OH溶液至刻度.于502.00nm处测定吸光度值记为Ax.无总黄酮样液的吸光度值记为A0；用C2H5OH代替n-OH-PhCOOH-C2H5OH溶液的吸光度值记为Ax0，地上部分总黄酮样液对羟基自由基的清除率计算公式为：

(4)超氧阴离子自由基抑制率的测定[7-8].取0.1mL～0.6mL(间隔0.1mL取样)的6个总黄酮实验样液到25mL的比色管中，水稀释到5mL后各加入4.7mLTris-HCl(pH=8.2)缓冲溶液，0.3mL1，2，3-苯三酚溶液(3mmol/L)，用纯水做空白.参照参考文献[7-8]操作并计算.

(5)DPPH清除率的测定[7-8].6支25mL比色管中分别取0.1mL～0.6mL(间隔0.1mL取样)的6个总黄酮实验样液，无水C2H5OH溶液定容到2mL，加2mLDPPH溶液，于暗处静置[13]，在波长502nm处测定的吸光度值记为A1，乙醇替换样液后吸光度值记为A2，乙醇替换2mLDPPH溶液吸光值记为A3.芦丁对照样的测定方法同上，参照参考文献[8-9]操作得到试样对DPPH的清除率为：

3 结果与讨论

3.1 大蓟中金属含量的测定结果

表1为大蓟根粉末和地上部分粉末各金属含量的测定结果.从表1可以看出：大蓟的根粉末和地上部分粉末均含有Zn、Mn、Ca、Na四种金属元素，都不含Cu和K两种元素；根和地上部分粉末中Ca和Na两种元素含量均较高，且地上部分Ca和Na含量明显高于根中Ca和Na含量.

表1 大蓟金属含量测定结果

3.2 总黄酮的提取及测定

3.2.1 总黄酮提取及测定结果

表2为采用不同浓度乙醇提取大蓟地根粉末和地上部分粉末总黄酮所得提取液的颜色变化表， 表3为大蓟根和地上部分总黄酮提取率统计表.从表2可以得出随着乙醇浓度的提高，根提取液的颜色由棕红过渡到棕黄最后变为黄色，地上部分提取液的颜色由棕黄过渡到黄色最后变为黄绿色.结合表2和表3可以看出：乙醇的最佳提取浓度为75 %，浓度低不能很好提取出所有总黄酮，浓度高于75%，则叶绿素等有机物和糖类物质也被提取出来，增加后期纯化的难度，故75 %为最佳提取浓度.另外，大蓟地上部分总黄酮的提取率高于根部分.

表2 不同乙醇浓度下提取液颜色变化表

表3 大蓟根和地上部分总黄酮提取率

结合表2和表3可以看出：乙醇的最佳提取浓度为75%，浓度低不能很好提取出所有总黄酮，浓度高于75%，则叶绿素等有机物和糖类物质也被提取出来，增加后期纯化的难度，故75%为最佳提取浓度.另外，大蓟地上部分总黄酮的提取率高于根部分.

3.2.2 地上部分总黄酮还原能力测定

由芦丁和地上部分总黄酮还原性比较图(图1)可以看出，随着样品浓度从0.000、1.386、2.772、4.159、5.545、6.932μg/mL升高，吸光度值逐渐增大，且均高于芦丁对照样品的吸光度值，当浓度增加到6.932 μg/mL时，样品和芦丁的吸光度值才几乎相等.测定结果表明：大蓟地上部分总黄酮具有一定的还原性，它可失去电子将Fe3+还原为Fe2+，还原能力随着质量浓度增加而增加，在相同浓度下，还原能力均高于芦丁对照样品.

3.2.3 地上部分总黄酮清除羟基自由基(·OH)结果

如芦丁和地上部分总黄酮清除羟基自由基比较图(图2)所示，地上部分总黄酮对羟基自由基·OH的清除能力随着总黄酮浓度的增加而增加，虽然在较低浓度时相比芦丁对照物清除能力明显要低，但是当浓度增加到5.856μg/mL时，地上部分总黄酮和芦丁对照物清除羟基自由基的能力相接近.

3.2.4 地上部分总黄酮清除超氧阴离子自由基(O2-·)结果

如芦丁和地上部分总黄酮清除超氧阴离子自由基比较图(图3)所示，大蓟地上部分总黄酮对超氧阴离子自由基(O2-·)的清除能力随着浓度的增加逐渐提高，且在较低浓度时就明显高于芦丁对照物，表明大蓟地上部分总黄酮具有较好的清除超氧阴离子自由基(O2-·)的能力.

3.2.5 地上部分总黄酮清除DPPH·自由基结果

如芦丁和地上部分总黄酮清除DPPH自由基比较图(图4)所示，大蓟地上部分总黄酮对DPPH·自由基也表现出很好的清除能力，且是随着大蓟地上部分总黄酮浓度的增加而增加，而芦丁对照物随着浓度的增加呈现出先增加后快速降低的趋势，而大蓟地上部分总黄酮清除DPPH·自由基能力则一直呈现升高的趋势且清除率明显优于芦丁.

图1 芦丁和地上部分总黄酮还原性比较

图2 芦丁和地上部分总黄酮清除羟基自由基比较

图3 芦丁和地上部分总黄酮清除超氧阴离子自由基比较

图4 芦丁和地上部分总黄酮清除DPPH自由基比较

4 结 论

(1)采用原子吸收分光光度计对大蓟根和地上部分六种金属元素钾(K)、钙(Ca)、钠(Na)、锌(Zn)、铜(Cu)和锰(Mn)含量进行分析测定，实验结果表明，根和地上部分中Na元素的含量最高，其次是Ca元素，且两种元素均是地上部分比根高；而K和Cu的含量均为0.

(2)大蓟根和地上部分采用75%乙醇超声提取所得总黄酮含量为12.120mg/g和14.940mg/g.

(3)大蓟地上部分总黄酮表现出较好的抗氧化活性，相比芦丁对照物，还原能力、清除超氧阴离子自由基能力和清除DPPH自由基能力都随着地上部分总黄酮浓度增加而增加，清除羟基自由基的能力也随着浓度增加呈现上升趋势，直至和芦丁清除能力一致.