LncRNA对胚胎发育的影响

张燕迪，任红艳，毕延震

（湖北省农业科学院畜牧兽医研究所/动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室，武汉 430064）

随着对基因转录的深入研究及高通量测序技术的广泛应用，不断有研究表明多数物种的基因组普遍被转录，导致LncRNA的不断产生。最开始，研究者认为LncRNA作为转录的副产物被表达出来，是基因序列中的“垃圾”，没有任何的生物学功能。但是，随后的研究中不断有证据表明LncRNA能够调控基因表达，是多种生物学过程的重要调节剂。近年来利用RNA-seq技术对哺乳动物着床前胚胎进行测序，发现有大量LncRNA表达，这些LncRNA在早期胚胎发育的不同阶段具有明显的时空表达特异性［1］。进一步研究证明LncRNA对胚胎正常发育具有重要调节作用，它参与生物体生长、发育、衰老、死亡等各种生物进程，其功能的异常会导致相关疾病发生［2-4］。目前为止，只有少数研究解析LncRNA对胚胎发育的功能，对于LncRNA在胚胎发育中的具体作用机制认识还不够全面。

1 LncRNA简介

LncRNA是一类转录本长度大于200核苷酸（Nucleotide，nt）、无蛋白质编码能力但具有生物学功能的RNA［5］。由日本科学家Okazaki等［6］通过对小鼠cDNA文库进行大规模测序时首次发现并命名。随机复制、染色体重排、转座子随机插入、逆转录转座作用和蛋白编码基因阅读框的改变是LncRNA产生的五种机制［7］。LncRNA与mRNA相似，由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polymeraseⅡ，RNAPⅡ）转录，有5′端帽子、3′端多聚腺苷酸（polyA）尾［8，9］。与mRNA不同的是，大多数LncRNA外显子数目少且较长，主要在细胞核内表达，保守性和表达丰度低，在细胞和组织中呈现特异性表达模式［10，11］。LncRNA分类标准多样，根据LncRNA与蛋白质编码基因在基因组上的相对位置分为正义链LncRNA（sense LncRNA）、反义链LncRNA（antisense LncRNA）、双向链LncRNA（bidirectional LncRNA）、内含子LncRNA（intronic LncRNA）和基因间LncRNA（intergenic LncRNA）五类［12］。根据LncRNA发挥的生物学功能分为信号分子（signal molecule）、引导分子（guid molecule）、支架分子（scaffold molecule）和诱饵分子（decoy molecule）［13，14］。cRNA在表观遗传学、转录、转录后水平调控基因表达，在基因组印记、X染色体失活、细胞周期调控等过程中起着重要作用［15，16］。

LncRNA通过表观遗传修饰（Epigenetic modification）参与转录前调控，就是通过DNA甲基化、组蛋白甲基化及乙酰化等调节有关基因表达［17］。LncRNA-Xist招募多梳蛋白抑制复合体2（polycomb repressive complex 2，PRC2）到X染色体，与AUCG四环结构作用，激活染色质修饰复合体中的甲基转移酶，引起组蛋白H3赖氨酸27三甲基化（H3K27me3），导致X染色体失活。LncRNA-Xist还可以与SHARP相互作用促进这种沉默［18］。来源于与胚胎发育相关的HOX基因座的LncRNA-HOTAIR与LSD1（赖氨酸特异性脱甲基酶1）和PRC2结合后，靶向基因组，引起H3K27甲基化和H3K4去甲基化，抑制基因表达［18，19］。

LncRNA主要通过调节增强子或启动子活性、转录因子及绝缘子功能等介导基因转录水平的调控。从增强子反义链转录来的LncRNA-Evf2通过与Dlx2形成RNA-蛋白质复合体，激活Dlx5和Dlx6的 增 强 子，促 进Dlx5和Dlx6基 因 表 达［20，21］。LncRNA-Airn能够覆盖在Igf2r启动子上，通过连续转录，阻止Igf2r启动子的转录起始。同时，Airn通过募集组蛋白甲基转移酶EHMT2到基因组的基因座上来调控Slc22a3表达［22］。有研究称脂多糖诱导的非编码RNA（LINoCR）通过解除下游绝缘子对增强子的抑制而激活靶基因LYZ的表达［23］。

LncRNA通过影响mRNA转运、剪接、降解等过程在转录后水平调控基因表达。LncRNA-MALAT1通过与SR（serine-and arginine-rich proteins family，富含丝氨酸/精氨酸的剪接调控蛋白家族）蛋白作用调节剪切因子磷酸化状态，使前体mRNA发生选择性剪切［24］。LncRNA-1/2-sbs RNA与3′端非编码区含有Alu元件的mRNA结合，促进mRNA与STAU1结合，引起Staufen1介导的降解（Staufen1-mediated decay，SMD）途径，导致mRNA降解［25］。LncRNANEAT1可以调控已经分化细胞中有关mRNA的核质转运［26］。高表达于胃癌细胞中的LncRNA-GHET1能提高c-MycmRNA的稳定性，促进其表达，进而影响细胞的增殖［27］。

2 胚胎发育简介

动物的胚胎发育是一个连续发展变化的过程，精卵融合使得父源遗传物质进入成熟卵母细胞，在生物学中将已受精的卵母细胞称为受精卵，其是由一个细胞组成的胚胎，包含着生物体生长发育所需的全部信息，在母体环境合适的条件下，经过卵裂期→桑椹胚→囊胚→原肠胚，有组织地对这些信息进行编码修饰，最终增殖发育成为一个新的个体［28］。胚胎发育过程复杂且有序，是在许多编码蛋白基因和非编码蛋白基因选择性特异时空表达及其表达产物相互作用形成精确调控网络的条件下完成的，某些基因的改变可能会引起胚胎发育异常，甚至导致先天畸形的发生，因此研究胚胎发育时期LncRNA调控功能具有重要作用。

胚胎发育过程中有一系列重要且独特的事件影响着胚胎的正常发育，例如MZT，其通过两个相互关联的过程将终末分化的精子和卵母细胞重编程到全能性，即母体蛋白及转录本mRNA的消除和胚胎发育所必需的ZGA［29，30］。从精子与成熟卵子受精到胚胎第一次分裂，胚胎发育是由卵母细胞中积累的母源RNA和蛋白质控制的，二细胞形成后，母源物质的表达下调，合子基因产生，合子基因组逐渐发挥主要调控作用，发育由母源基因产物控制转向合子基因产物控制，若这个过渡不能顺利完成，就会造成胚胎发育的阻滞。由于原始存留的蛋白质和RNA量及种类的不同，导致各物种之间MZT所处的时间点不同［31］。合子基因组激活也是一个很重要的过程，改变了胚胎内基因组的表达模式，是胚胎具备形成各种细胞类型能力的关键，与染色质状态、细胞周期、核质成分比例变化等胚胎事件协调发生。ZGA通常包括两个阶段，开始的低水平转录和随后的爆发式表达。有三类模型用于研究ZGA的调控机制：第一类是母源调控模型；第二类是核质比模型；第三类是染色质重塑模型［32］。Assou等［33］研究表明内细胞团和滋养层分离也是胚胎发育过程中的一个重要事件。

3 LncRNA参与胚胎发育

在胚胎发育过程中，通过胚胎和祖细胞中关键基因的精确时空激活来实现细胞谱系的规格和分化。不断有研究发现动物和人类植入前胚胎中存在一些与胚胎发育相关的LncRNA，但其功能研究相对缺乏。敲除牛胚胎中某些特定的LncRNA会影响胚胎的生长，导致胚胎发育率的提高和囊胚体积的增大。利用锁核酸（Locked nucleic acid，LNC）对猪胚胎发育中的lincRNA-TCONS-00166370进行功能缺失实验，发现TCONS-00166370影响胚胎正常纺锤体的形成，造成猪早期胚胎卵裂异常［34］。在小鼠中，siRNA介导的启动子相关LncRNA（promoter-associated noncoding RNAs，pancRNAs）沉默在二细胞期胚胎中特异表达，导致胚胎死亡，这种表型可以通过表达与这种LncRNA相互作用的蛋白质来挽救。对人植入前胚胎单细胞和人胚胎干细胞（hESCs）RNA-seq数据的 分析 表明，有3 405个LncRNAs表达，其中2 733个是潜在的基因间非编码RNA。进一步研究发现早期人类胚胎和分化细胞中有相当明显的LncRNA谱，LncRNAs是人类早期胚胎发育过程中转录表达动态变化的一部分，也是胚胎发育过程中形态发生剧烈变化的原因之一。由于在胚胎发育的特定和关键阶段检测到了一些LncRNAs，所以它们可作为胚胎发育能力和ZGA的候选标记物［35］。上述研究结果表明LncRNA在胚胎发育过程中具有重要作用，但大部分LncRNA的功能和机制还需进一步研究。

3.1 LncRNA参与卵母细胞成熟与精子发生

卵母细胞质量影响着胚胎发育能力，卵母细胞中的LncRNA对卵母细胞起到调控作用。Yerushalmi等［36］报道在生发泡期（germinal vesicle，GV）和成熟（MII）期卵母细胞以及高质量和劣质的植入前胚胎中，都有特异性LncRNA在卵丘细胞中差异表达，而且这些LncRNA在胚胎发育过程中呈现动态变化。此外，与无多囊卵巢综合征的女性相比，多囊卵巢综合征患者的卵丘细胞异常表达LncRNA，提示LncRNA的表达可能影响卵母细胞的能力。LncRNA可通过调节卵母细胞减数分裂、高度不饱和脂肪酸的合成、细胞表面信号传导以及颗粒细胞表面蛋白参与细胞粘附等过程，从而调节卵母细胞成熟。LncRNA的表达谱不仅可以反映胚胎的发育阶段，也可以反映颗粒细胞和卵丘细胞的发育阶段，用实时定量逆转录聚合酶链式反应（Real time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）技术对卵丘细胞中表达的LncRNA进行分析［35］。精子是由精原干细胞分化而来的，研究报道Mrhl（Miotic recombination hot spot locus）、Neat1（Nuclear paraspeckle assembly transcript 1）和HongrES2等LncRNA调控精子发生过程。Mrhl通过与p68相互作用抑制Wnt通路，从而调控精子发生，干扰Neat1的表达会降低曲精小管中精子含量，HongrES2利用其产生的一段与miRNA类似的片段抑制CES7表达，导致精子获能受到影响［14］。

3.2 LncRNA参与合子基因组激活

合子基因组激活（ZGA）对胚胎发育具有重要作用，LncRNA参与调控ZGA过程。Wang等［37］发现与内源逆转录（Endogeneous retrovirues，ERVs）相关的Linc-GET对小 鼠ZGA过程至 关重 要，Linc-GET表达于小鼠胚胎着床前二细胞晚期到四细胞阶段，其通过与ILF2（Interleukin enhancer binding factor 2）、FUBP1（Far upstream element binding protein 1）及hnRNPU（Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein U）形成RNA-蛋白质复合物，启动ERVK、GLN和MERVL长末端重复序列顺式调控活动，同时可降低ILF2、FUBP1和hnRNPU的表达，抑制RNA的可选择性剪接。功能缺失实验结果表明，Linc-GET缺失不仅会抑制MAPK信号通路，也会造成小鼠胚胎阻滞于二细胞时期G2阶段。所以说Linc-GET对小鼠胚胎二细胞阶段正确转录、合子激活、RNA可变剪接具有重要的调控作用。Hamazaki等［38］研究发现ZGA时期特定的LncRNA-Il17d（pancRNA）能够顺式增强其邻近蛋白质编码基因白细胞介素家族成员Il17d的表达，从而驱动后续胚胎发育，敲低LncRNA-Il17d会导致胚胎死亡，过表达Il17d可以挽救上述致死现象。Linc28也被认为是人和小鼠EGA网络中的一个关键基因，其缺失会造成小鼠胚胎二细胞到四细胞阶段的发育停滞。LncRNA-Gtl2在胚胎发育不同时期的表达模式及亚细胞定位有所变化，其对胚胎发育具有潜在重要作用，对囊胚细胞分化和体外扩张能力有影响，干细胞多能性因子和组蛋白修饰可以调控其表达［39］。以上研究表明LncRNA参与调控胚胎发育。

3.3 LncRNA参与调控胚胎干细胞多能性

胚胎干细胞（Embryonic stem cells，ESCs）是具有多能性和自我更新能力的细胞，其可以分化为任何一种身体细胞类型，在研究胚胎发育过程中具有重要作用。为了研究LncRNA在ESCs中的作用及机制，研究人员通过微阵列和Chip-seq实验，在小鼠体内获得了第一批将LncRNA与ESCs调控联系起来的数据，研究表明，小鼠ESCs具有特定的LncRNA信号在分化过程中丢失，Guttman等［40］在小鼠ESCs中发现了1 000多个能够编码基因的LncRNAs。其中许多LncRNAs是由多能相关转录因子Sox2（sex determining region Y）、Oct4（Octamer-binding transcription factor 4）和Nanog调控，LncRNA表达水平的变化会改变Sox2、Oct4和Nanog的表达，导致小鼠ESCs发生转录组变异，进而影响ESCs多能性和分化。以上研究表明LncRNA参与调控胚胎干细胞多能性，其机制主要有结合表观修饰物、吸附miRNA、与RNA结合蛋白作用这三种［14］。

4 展望

由于LncRNA所具有的多种分子生物学功能和其表达的时空特异性，有理由相信LncRNA在胚胎发育过程中起着关键作用，但目前的研究多局限于LncRNA与疾病相关的方面，LncRNA参与调控胚胎发育的研究仍处于早期阶段，与胚胎中已发现的LncRNA数量相比，现有的研究成果远远不够，其如何调控胚胎发育过程的机制至今尚不完全清楚，有待科研工作者进一步研究。所以鉴定多种物种胚胎中更多的LncRNA，并阐明关键LncRNA的调控机理将会是今后的主要研究方向，这将为疾病的早期预警及控制治疗提供参考，为解决医学难题开创新思路。