血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平在乳腺癌早期诊断中的临床意义

于秀艳, 田春迎, 张晓伟, 吴雪峰

（吉林省肿瘤医院检验科，吉林 长春 130012）

癌胚抗原相关细胞黏附分子19（carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 19，CEACAM19）是癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）家族的新成员，也称为CEA样基因1（CEA-like gene 1，CEAL1），在肿瘤患者中表达灵敏性高［1］，目前有关CEACAM19 与乳腺癌关系的研究鲜有报道，且现有研究均为乳腺癌组织样本的免疫组织化学分析。在乳腺癌组织中的研究［2-3］证 实 了CEACAM19 具有较高的临床应用价值。MICHAELIDOU 等［2］和ESTIAR 等［3］证 实： 与正常组织比较，乳腺癌组织中CEACAM19 mRNA高表达。但关于CEACAM19 在乳腺癌外周血中的研究尚未见报道。乳腺上皮小黏蛋白（small breast epithelial mucin，SBEM）是MIKSICEK 等［4］于2002年首次发现，具有高度的特异性，在乳腺和唾液腺组织中表达。LI 等［5］和ZHANG 等［6］近 期在乳腺癌细胞系和组织中的研究表明：SBEM 可通过促进上皮- 间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）来促进乳腺癌细胞迁移和侵袭，SBEM 可作为乳腺癌转移诊断和疾病评估的潜在组织标志物。而关于SBEM 在乳腺癌患者血清中的研究十分有限。人乳腺珠蛋白（human mammaglobin，hMAM）是一种分泌糖蛋白，具有高度的特异性，几乎只在乳腺上皮细胞和乳腺癌组织中表达，在其他肿瘤组织（肺癌、卵巢癌、前列腺癌和恶性黑色素瘤等）中不表达［7］。国内外研究［8-11］表 明：hMAM 在乳腺癌患者的诊断、治 疗和预后生存中起重要作用。针对hMAM 的检测方法逐渐受到重视，目前已有关于hMAM 检测最新方法学建立的研究［12］报道。本课题组前期研究［13-14］显示：hMAM 检测在乳腺癌诊断和微转移判断中具有重要临床意义。目前，国内外关于SBEM 和hMAM 在乳腺癌中作用的研究仍处于起步阶段，有关乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平联合检测的研究尚未见报道。乳腺癌患者血清SBEM 和hMAM 的表达特异性均较高，而CEACAM19 作为CEA家族的新成员，在肿瘤诊断中具有高灵敏性特点，本文作者推测：血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平联合检测可能明显提高乳腺癌诊断的灵敏度和特异度。与穿刺组织活检等侵入性操作比较，外周血样本的获得简便易行，患者的依从性高，适宜进行乳腺癌的早期筛查诊断。因此，本研究采用ELISA 法检测乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平，并分析其与患者临床病理参数的关系，为建立可靠和可行的乳腺癌早期诊断检测方法提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料随机选择2019年8月— 2021年4月在本院乳腺科经病理确诊为乳腺癌的80例首诊早期患者作为乳腺癌组，年龄30～74岁，平均年龄为（50.44±9.21）岁，TNM分期Ⅰ-Ⅱ期，乳腺癌患者组织学类型：浸润性导管癌69例，浸润性小叶癌5例，黏液癌4例，混合型癌2例；同时随机选取58例同期在本院经病理确诊为乳腺良性病变的首诊患者作为乳腺良性病变组，年龄31～67岁，平均年龄为（49.22±8.86）岁，包括乳腺纤维腺瘤33例，乳腺腺病14例，导管内乳头状瘤9例，乳腺囊肿2例；随机选取54名同期来本院体检的健康女性作为健康对照组，年龄24～77岁，平均年龄为（50.48±12.73）岁。乳腺癌组、乳腺良性病变组和健康对照组研究对象年龄分布比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明研究具有可比性。为了比较TNM分期Ⅲ-Ⅳ期和Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平的差异，在80例Ⅰ-Ⅱ期乳腺癌组患者基础上又另外选取22例Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者，并对其TNM分期单独进行统计。

1.2 诊断标准、纳入标准和排除标准诊断标准：乳腺癌和乳腺良性病变均经病理确诊。乳腺癌分子分型依据2013年St Gallen 乳腺癌会议国际专家共识。乳腺癌的TNM分期标准依据国际抗癌联盟UICC 2003 版制订的TNM分期法。纳入标准：乳腺癌组和乳腺良性病变组患者均为女性，均为乳腺癌或乳腺良性病变首诊患者，均有明确的病理学诊断依据，乳腺癌组患者TNM分期明确为早期，均签署知情同意书，术前未接受过放疗、化疗、内分泌治疗或生物治疗等干预措施；健康对照组志愿者均为女性，标本来源为本院体检中心的健康体检者，均签订知情同意书，彩色超声和CT 等影像检查结果正常，血常规、尿常规、便常规、生化常规和肿瘤标志物检测结果均正常。排除标准：乳腺癌组和乳腺良性病变组患者有既往肿瘤病史，并发其他部位原发性肿瘤的患者，存在严重感染性疾病、糖尿病、心脏疾病、肝肾疾病、自身免疫性疾病和高血压病［收缩压≥140 mmHg和（或）舒张压≥90 mmHg］，认知功能障碍和其他精神障碍，病历资料不完整，标本溶血、乳糜血和黄疸；健康对照组志愿者有既往肿瘤病史，有既往自身免疫性疾病，标本溶血、乳糜血和黄疸。

1.3 主要试剂和仪器人CEACAM19 ELISA 试剂盒和人hMAM ELISA 试剂盒（上海博湖生物科技有限公司），人SBEM 试剂盒（美国CLOUDCLONE CORP 公司）。安图PHOMO 型酶标仪和安图iWO-960 型洗板机（郑州安图生物工程有限公司）。

1.4 血液标本的采集患者入院第1天抽取空腹肘静脉血约5 mL，室温静置30 min，3 500 r·min－1离心10 min，取上清分装，保存于－20℃冰箱待检测。

1.5 ELISA 法检测3组研究对象血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平采 用ELISA 法检测乳腺癌组、乳腺良性病变组和健康对照组研究对象血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平，结果以中位数（四分位数）［M（P25，P75）］ 表示，ELISA 法操作步骤严格按试剂盒说明书进行，冲洗步骤采用安图iWO-960 型洗板机自动清洗，数据由安图PHOMO 型酶标仪读取，均在450 nm 波长处测定吸光度（A）值。

1.6 乳腺癌患者病理检查结果的判定乳腺癌患者手术切除病理标本雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，Her-2）、肿瘤增殖 抗 原Ki67（tumor proliferation antigen Ki67 ，Ki-67）、雄激素受体（androgen receptor，AR）、蛋白53（protein 53，P53）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和蛋白63（protein 63，P63）表达检测由本院病理科完成。①ER和PR的判断，阳性：≥1% 的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色，阴性：＜1% 的肿瘤细胞核呈现不同程度的着色或完全无着色［15］。②Her-2的判断，阳性：结果为或结果为后行荧光原位杂交技术（fluorescencein situhybridization，FISH）检测后为阳性。阴性：指结果为0或+或结果为后行FISH 检测后为阴性［16］。③Ki-67 和P53的判断，Ki-67 阳性：癌细胞中阳性染色细胞百分率≥14%；阴性：癌细胞中阳性染色细胞百分率＜14%。P53阳性：阳性细胞百分率≥10%，P53 阴性：阳性细胞百分率＜10%［17］。④AR 的判断，阳性：阳性细胞着色百分率≥1%，阴性：阳性细胞着色百分率＜1%［18］。⑤EGFR 的判断，阳性：阳性细胞百分率≥5%，阴性：阳性细胞百分率＜5%［17］。⑥P63 的判断，阳性：阳性细胞百分率≥10%，阴性：阳性细胞百分率＜10%［17］。

1.7 统计学分析采用SPSS 25.0 统计软件进行统计学分析。Shapiro-Wilk 法行正态分布检验，以P＞0.05 为满足正态分布，因所有检测指标的分布均不满足正态分布，两组间比较采用Wilcoxon 秩和检验，多组间比较采用Kruskal-Wallis 检验，当差异有统计学意义时，采用Bonferroni 校正法进行两两比较，以M（P25，P75）表示。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线分析各指标诊断乳腺癌的曲线下面积（area under curve，AUC）、cut-off 值、灵敏度和特异度，各指标的最优临床cut-off 值采用约登系数确定。SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平联合检测的ROC 曲线分析需先采用二元Logistic 回归分析计算出预测概率再行ROC 曲线分析。灵敏度和特异度计算公式：灵敏度=真阳性例数/（真阳性例数+假阴性例数）×100%，特异度=真阴性例数/（假阳性例数+真阴性例数）×100%。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组研究对象血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平经Shapiro-Wilk 法行正态分布检验，SBEM 统计量为0.750，P＜0.05；hMAM统计量为0.929，P＜0.05；CEACAM19 统计量为0.885，P＜0.05，均不满足正态分布，多组间比较采用Kruskal-Wallis 秩和检验，经检验差异有统计学意义，采用Bonferroni-Dunn 校正法进行多重比较。乳腺癌组患者血清SBEM 水平明显高于乳腺良性病变组和健康对照组（P＜0.05）；乳腺癌组患者血清hMAM 水平明显高于乳腺良性病变组和健康对照组（P＜0.05）；乳腺癌组患者血清CEACAM19 水平明显高于乳腺良性病变组和健康对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 3组研究对象血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平Tab.1 Serum levels of SBEM, hMAM, and CEACAM19 of subjects in three groups ［M(P25，P75)］

2.2 3组研究对象血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平诊断乳腺癌的效能SBEM水平检测的AUC 为0.868（95%CI： 0.809～0.926）；hMAM水平检测的AUC 为0.809（95%CI：0.747～0.871）；CEACAM19 的AUC 为0.756（95%CI： 0.689～0.823）；SBEM+hMAM+CEACAM19水平联合检测的AUC 为0.913（95%CI： 0.869～0.958）。SBEM 诊断乳腺癌的cut-off 值为4.05 μg·L－1，灵敏度 和特异度分 别为80.0% 和88.4%；hMAM 诊断乳腺癌的cut-off 值为158.87 ng·L－1，灵敏度和特异度分别为70.0%和80.4%；CEACAM19 诊断乳腺癌的cut-off 值为48.23 ng·L－1，灵敏度和特异度分别为97.5% 和50.9%。SBEM、hMAM和CEACAM19水平联合检测筛查乳腺癌的灵敏度和特异度分别为82.5%和90.2%。见图1和表2。

图1 SBEM、hMAM 和CEACAM19 单独和联合诊断乳腺癌的ROC 曲线Fig.1 ROC curves of SBEM, hMAM, and CEACAM19 alone or combined in diagnosis of breast cancer

表2 血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平对乳腺癌的诊断效能Tab.2 Efficiency of SBEM, hMAM, and CEACAM19 levels in serum in diagnosis of breast cancer

2.3 乳腺癌患者免疫组织化学检测指标乳腺癌患者ER、PR、Her-2、Ki-67、AR、P53、EGFR和P63 的阳性表达率分别为80.00%、75.00%、20.00%、82.50%、83.78%、41.18%、32.26%及22.22%。见表3。

2.4 乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平与临床病理学参数的关系乳腺癌组患者3个指标经Shapiro-Wilk 法行正态分布检验，SBEM 统计量为0.891，P＜0.05；hMAM 统计量为0.944，P＜0.002；CEACAM19 统计量为0.833，P＜0.05，均不满足正态分布，两组间比较采用Wilcoxon 秩和检验。乳腺癌组患者血清SBEM 水平与临床分期和淋巴结转移有关（P＜0.05），TNM分期Ⅲ-Ⅳ期患者SBEM 水平明显高于临床分期Ⅰ-Ⅱ期患者（P＜0.05），淋巴结转移阳性组患者血清SBEM 水平明显高于淋巴结转移阴性组（P＜0.05），但血清SBEM 水平与患者的年龄、肿瘤最大直径、ER、PR、Her-2、Ki-67、AR、P53、EGFR 和P63 无关联（P＞0.05）；乳腺癌组患者血清hMAM 水平与临床分期和淋巴结转移有关联（P＜0.05），TNM分期Ⅲ-Ⅳ期患者血清hMAM 水平明显高于TNM分期Ⅰ-Ⅱ期患者（P＜0.05），淋巴结转移阳性患者血清hMAM 水平明显高于淋巴结阴性者（P＜0.05），与患者的年龄、肿瘤最大直径、ER、PR、Her-2、Ki-67、AR、P53、EGFR 和P63 无关联（P＞0.05）；乳腺癌组患者血清CEACAM19 水平与临床分期、淋巴结转移、肿瘤最 大直径和P53 有关联（P＜0.05），TNM分期Ⅲ-Ⅳ期患者血清CEACAM19 水平明显高于TNM分期Ⅰ-Ⅱ期患者（P＜0.05），淋巴结转移阳性组患者血清CEACAM19 水平明显高于淋巴结阴性者（P＜0.05），肿瘤最大直径＞2 cm 患者血清CEACAM19水平明显高于肿瘤最大直径≤2 cm 者（P＜0.05），P53阳性患者血清CEACAM19水平明显高于P53阴性者（P＜0.05），但血清CEACAM19 水平与患者的年龄、ER、PR、Her-2、Ki-67、AR、EGFR和P63无关联（P＞0.05）。见表3。

表3 乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平与临床病理学参数的关系Tab.3 Relationships between levels of SBEM, hMAM ,and CEACAM19 in serum and clinicopathological parameters of breast cancer patients ［M（P25，P75）］

3 讨 论

乳腺癌是全球女性最常见的恶性肿瘤，并且已成为全球女性癌症相关死亡的主要原因［19-20］。由于多数乳腺癌患者确诊时已经处于中晚期，手术切除是主要的治疗方法，但即使切除癌组织，乳腺癌也可能发生转移［21］。乳腺癌转移患者复发率高，5年生存率低，且乳腺癌的病因尚不完全清楚［22］。早期诊断和早期治疗可以提高乳腺癌的疗效，改善患者预后［23］。因此，目前临床上迫切需要更好的方法来早期诊断乳腺癌。在近几十年的研究中，学者们报道了大量乳腺癌潜在血清肿瘤标志物的诊断效能，而绝大多数未能应用于临床，常用的乳腺癌标志物包括CA153、CA125 和CEA，但缺乏灵敏性和特异性。迄今为止尚无一种肿瘤标志物能够非常敏感和特异地检测乳腺癌的发生和监测乳腺癌患者病情变化，而肿瘤标志物的联合检测方式有望筛选出一种高效的乳腺癌诊断方法。CEACAM 是CEA家族的一个亚群，存在于一系列不同的细胞类型和器官中，对CEACAM成员（CEACAM1、CEACAM5和CEACAM6 等）的研究［24］表 明：CEACAM 参与许多生理过程，包括细胞黏附、增殖、分化和肿瘤抑制等。而SBEM 和hMAM由于其组织特异性，近年来成为乳腺癌生物标志物研究的热点，但检测方法十分有限，并且各研究的结论差异较大。目前国内外针对乳腺癌患者SBEM、hMAM 和CEACAM19 的研究样本多为组织样本，且多采用实时荧光定量PCR（Real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法或免疫组织化学法，这些方法具有足够的灵敏性和可靠性，在乳腺癌患者的诊断和治疗中起决定性作用，但是由于方法复杂、费用较高和时间较长，并不适宜患者早期诊断筛查和转移复发的监测。而本研究采用的ELISA 法恰好能弥补上述不足，并且检测过程几乎无创，还可进行重复检测，患者的依从性高。

本研究结果显示：SBEM、hMAM 和CEACAM19 联合检测的AUC 为0.913，高于三者单独检测的结果，说明联合检测的诊断效能最佳。SBEM 诊断乳腺癌的灵敏度和特异度分别为80.0% 和88.4%，诊断特异度最高；hMAM 诊断乳腺癌的灵敏度和特异度分别为70.0% 和80.4%，诊断的灵敏度差、特异度适中；CEACAM19 诊断乳腺癌的灵敏度和特异度分别为97.5% 和50.9%，诊断的灵敏度最高但特异度最差；三者联合检测乳腺癌的灵敏度和特异度分别为82.5% 和90.2%，虽然相较于CEACAM19 单独检测的敏感度有所降低，但却明显优于SBEM 和hMAM 单独检测的灵敏度，而联合检测的特异度却明显优于各指标单独检测的特异度。因此，联合检测能够有效平衡各指标的利弊，弥补单项指标检测的不足，提升乳腺癌整体诊断效能。

针对SBEM 和hMAM mRNA 及蛋白水平的报道较多，而CEACAM19 是一个新发现的标志物，其mRNA 和蛋白水平的相关报道较少。ZHANG 等［6］分别采用Western blotting 法 和RT-qPCR 法证实在乳腺癌组织中SBEM mRNA 和蛋白表达水平均明显高于正常乳腺组织。JOUDI 等［25］通 过Northern 印迹和RT-qPCR 技术，在90% 的恶性乳腺癌组织中检测到hMAM mRNA表达，而在良性乳腺组织或健康乳腺组织中未检测到其表达，或者检测到的表达水平较低。本课题组前期研究［14］显示：乳腺癌患者血清hMAM 水平均高于健康对照组和乳腺纤维腺瘤组。ESTIAR 等［3］采用RT-PCR 法证实：与正常组织比较，乳腺癌组织中CEACAM19 mRNA 呈高表达。本研究结果显示：乳腺癌组患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平均明显高于乳腺良性病变组和健康对照组。本研究结果与本课题组［14］、ZHANG等［6］、JOUDI 等［25］和ESTIAR 等［3］在乳腺癌患者组织或血清中的研究结果一致，进一步说明血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平对于区分乳腺癌、乳腺良性病变和健康人群具有较好的效能。

乳腺癌TNM分期和淋巴结转移状态是评价肿瘤恶性程度的关键病理参数。研究［26］显示：在乳腺肿瘤上皮细胞和转移的腋窝淋巴结中检测到SBEM mRNA 高表达，SBEM mRNA 和蛋白表达水平与更高的肿瘤分级、TNM分期和淋巴结转移相关。ZHANG 等［6］研究表明：SBEM 的表达与乳腺癌TNM分期呈正相关关系，且多因素条件Logistic 回归分析显示TNM分期和SBEM 是乳腺癌恶性转移的独立危险因素。本课题组前期研究［14］显示：有淋巴结转移乳腺癌患者血清hMAM阳性表达率明显高于无淋巴结转移患者，但不同TNM分期患者血清hMAM 阳性表达率比较差异无统 计学意义。于洪涛等［27］采 用RT-qPCR法证实：乳腺癌淋巴结转移癌组织中CEACAM19 mRNA 表达水平明显高于原发癌组织。本研究结果显示：TNM分期Ⅲ-Ⅳ期乳腺癌患者血清SBEM、hMAM和CEACAM19 水平均明显高于TNM分期Ⅰ-Ⅱ期患者；淋巴结转移阳性乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平均明显高于淋巴结转移阴性患者，提示SBEM、hMAM 和CEACAM19 高表达与乳腺癌恶化和肿瘤细胞的侵袭性行为相关。SBEM、hMAM 和CEACAM19 可能均参与了乳腺癌的发生发展和转移过程，可作为乳腺癌转移诊断和疾病评估的潜在外周血生物标志物。但目其相关机制的研究报道十分有限。LI等［5］对SBEM 的机制研究显示：SBEM 能促进上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）。在乳腺癌MCF-7 细胞中过表达SBEM 后，细胞中N-cadherin、Twist 和vimentin表达水平升高，而E-cadherin 和claudin-1 表达水平降低，导致乳腺癌细胞形态改变而更具侵袭性、细胞黏附力降低、诱导血管生成，并且NF-κB、Notch、Wnt/β-catenin和PI3K/AKT 等信号通路均与EMT 过程相关。乳腺癌细胞系中缺乏hMAM 机制研究，但关于子宫内膜癌的研究［28］显示：hMAM 低表达促进了血管中内皮生长因子、KRAS 和PI3K-AKT-mTOR 信号通路活化。在MGC-803 细胞中敲除CEACAM19 降低了肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，AKT 和p65 的磷酸化水平也降低，这可能与PI3K/AKT 和NF-κB 信号通路失活有关［29-30］。这些机制的研究更加佐证了本研究的结论，即SBEM、hMAM 和CEACAM19 在肿瘤发生发展中的作用机制和途径可能是相似的，与NF- κB、Wnt/β-catenin 和PI3K/AKT 等肿瘤调控经典信号通路可能有关，确定哪些信号通路参与其中并找出重要靶点是未来重要的研究方向。

综上所述，乳腺癌患者血清SBEM、hMAM 和CEACAM19 水平均与患者高临床分期和淋巴结转移有关联，特别是SBEM 和hMAM 均具备乳腺组织特异性，可用于乳腺癌微转移的判断、预后评估和转移复发的监测。