小鼠孕期七氟醚暴露对后代母系行为学的影响及氢气的保护机制

黄代强, 刘朋飞, 何建斌, 孙静雪, 袁 琳, 袁 静, 赵 雷

（1.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院麻醉科，广东 深圳 518020；2.深圳市人民医院 暨南大学第二临床医学院 南方科技大学第一附属医院日间手术中心，广东 深圳 518020）

在胚胎阶段，机体各组织器官处于发生、分化和发育最敏感的阶段。脑发育是胎儿发育的重要组成部分，各种内外环境的改变和高危因素都可能对发育中的脑组织造成威胁，而脑发育异常最终导致多种临床疾病（包括社会行为异常等）［1-2］。七氟醚血气分配系数小，诱导苏醒迅速，麻醉安全性高，已经成为儿科和产科全身麻醉诱导和维持中最常使用的吸入性麻醉药［3］。有研究［4-5］显示：新生小鼠接受七氟醚麻醉后，不但出现学习障碍，而且出现反常的社会行为，如自闭症谱系障碍，但其具体机制尚未阐明。研究［6］显示：婴幼儿期接触过七氟醚的小鼠，母系行为缺失，尽管分娩过程正常，但新生小鼠死亡率明显增高，其具体机制尚未阐明［6］。目前，国内外尚无关于孕期七氟醚暴露是否同样导致新生小鼠成年后母系行为缺失的研究报道。有研究［7-8］显示：抗氧化治疗可以保护新生儿期小鼠七氟醚暴露引起的神经元毒性，这种抗氧化治疗可以减轻神经元凋亡，同时减轻学习能力损害的程度。SCHULTZ 等［9］将氢气（H2）用作气体载体与七氟醚混合，作用于新生小鼠，结果显示H2可能对七氟醚的神经毒性起保护作用。本研究将孕鼠暴露于H2与七氟醚混合的气体中，观察其能否改善1代小鼠成年后的母系行为，如果能够得到改善，说明胎儿期接触七氟醚导致的母系行为缺失的部分原因是由于过氧化损伤导致，并探讨治疗异常行为的办法。同时，本研究设计了2种不同浓度的抗氧化剂，期望通过对照研究得出最佳的治疗浓度。本研究分析小鼠胎儿期七氟醚暴露后1代新生小鼠成年后的母系行为，观察孕期接触七氟醚是否导致后代母系行为表达异常，探讨其可能的机制及预防治疗措施等，为临床上孕产妇麻醉剂的使用和药物开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要试剂和仪器40只怀孕15～16 d 的C57BL/6 小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产合格证号：SCXK（京）2016-0006。血管加压素ELISA 试剂盒购自美国Biovision 公司，催产素ELISA 试剂盒、兔抗c-Fos多克隆抗体、兔抗PARP 多克隆抗体和兔抗Caspase 3 多克隆抗体均购自英国Abcam 公司，小鼠抗GAPDH 单克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司，HRP 标记羊抗兔IgG、羊抗鼠IgG 和ECL 发光液均购自美国Sigma 公司。EXL-808 酶标检测仪购自美国宝特公司，Western blotting 电泳设备购自上海天能公司。

1.2 实验动物分组和处理方法小鼠每日12h光照（7： 00～19： 00），室温维持在（21±1）℃，湿度维持在45%～60%。小鼠自主饮食。将怀孕15～16 d C57BL/6 小鼠随机分为正常对照组、2% 七氟醚组、2%七氟醚+1% H2组和2%七氟醚+4% H2组。4组小鼠均以50% O2+ 50% N2为载气，各组小鼠处理时间均为6 h·d－1，连续处理3 d 后，各组孕鼠继续喂养，其后代（1代）在受孕后被用来进行后续实验。本实验通过深圳市人民医院伦理委员会批准。

1.3 各组1代小鼠母系行为学评价7～9周龄大的1代小鼠与健康成年雄性小鼠配种，进行母系社会行为学的分析。各组取10只雌性小鼠进行实验，所有母系行为评价均由同一观察员记录：①记录各组2代幼崽需要采用牛奶喂养的数量；②记录各组中不清洁的2代幼崽数量，不清洁的定义包括胎盘、羊膜或者脐带的残留；③评价各组母鼠做窝质量评分，一共分4级（0级：无边缘，计0分；1级：窝的四周边缘低平，计1分；2级：窝的四周边缘中等高度，计2分；3级：窝的形状像一个中空形状，四周边缘高的盒子，计3分）；④取回幼崽实验：每只2代幼崽被隔离30 min 后，将1代小鼠放在一个盒子的1个角，2代幼崽放在其他3个角，连续观察10 min。记录1代小鼠第1次去嗅2代幼崽的时间和将2代幼崽重新放回窝内的时间；⑤幼崽交换抚育实验：将2% 七氟醚组2代幼崽交给正常对照组1代小鼠进行喂养，同时，将正常对照组2代幼崽交给2% 七氟醚组1代小鼠喂养，观察两者存活率差异。存活率=交换后存活幼崽数量/交换后幼崽总数×100%。

1.4 各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平检测分娩后6h处死各组1代孕鼠，收集各组孕鼠的血浆，按照催产素和血管加压素ELISA 试剂盒说明书操作，检测各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平。

1.5 Western blotting 法检测各组孕鼠下丘脑内侧视前区组织中相关蛋白表达水平处死孕鼠后，取各组孕鼠下丘脑内侧视前区组织，采用Western blotting 法检测各组孕鼠下丘脑内侧视前区组织中c-Fos癌基因（c-Fos proto-oncogene，c-Fos）、多聚ADP核糖聚合酶1（poly ADP-ribose polymerase 1，PARP1）、剪切的PARP1（cleaved PARP1）、Caspase 3和剪切的Caspase 3（cleaved Caspase 3）蛋白表达水平。

1.6 统计学分析采用GraphPad Prism 5 统计软件进行统计学分析。各组小鼠血浆中催产素和血管加压素的水平，下丘脑内侧视前区组织中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表达水平符合正态分析，均以±s表示。各组小鼠牛奶喂养数量、不清洁2代幼崽数量、母鼠做窝质量、取回幼崽的时间和幼崽交换抚育的存活率以±s 表示。各组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 1代孕鼠母系行为评价指标1代孕鼠分娩后，各组均未见任何需要牛奶喂养的2代幼崽，此外，也未见任何不清洁的2代幼崽。各组母鼠做窝质量评分结果显示：各组母鼠做窝质量十分相近，大多数鼠窝呈中空形状，四周边缘较高，各组母鼠做窝质量评分比较差异无统计学意义（P＞0.05）。取回幼崽实验中，2% 七氟醚组母鼠第1次去嗅幼崽时间明显长于正常对照组（P＜0.05），将幼崽取回放入窝内时间也明显长于正常对照组（P＜0.05），表明七氟醚在一定程度上影响了母鼠的母系行为学，2% 七氟醚+1% H2组和2% 七氟醚+4% H2组1代母鼠第1次去嗅幼崽时间和将幼崽取回放入窝内的时间缩短（P＜0.05），2% 七氟醚+4% H2组母鼠将幼崽取回放入窝内的时间与正常对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。H2可能对七氟醚引起的母系行为学障碍有一定防护作用。正常对照组和2% 七氟醚组母鼠的幼崽交换抚育成活率比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 各组1代小鼠母系行为学评价指标Tab.1 Indexes of matrilineal behavioral evaluation of 1st-generation mice (n=10，±s）

表1 各组1代小鼠母系行为学评价指标Tab.1 Indexes of matrilineal behavioral evaluation of 1st-generation mice (n=10，±s）

“－”：No data.*P＜0.05 vs normal control group；△P＜0.05 vs 2% sevflurane+1% H2 group.

Group Normal control 2% sevoflurane 2% sevoflurane +1% H2 2% sevoflurane +4% H2 Score of nest quality 2.8±1.03 2.8±1.03 2.7±0.94 2.7±0.78 Time to sniff pups (t/s)48.5±9.85 77.9±13.9*70.9±9.05*59.9±9.83*△Time to retrieve pups and put into nest (t/s)396.1±69.5 553.0±49.2*536.8±51.0*456.6±67.8*△Survival rate of 2ndgeneration exchange pups(η/%)96.9±4.98 92.2±10.7－ －

2.2 各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明胎儿期七氟醚暴露并不影响雌性激素的水平。见表2。

表2 各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平Tab.2 Levels of oxytocin and vasopressin in plasma of 1stgeneration mice in various groups [n=10,±s,ρB/(ng•L-1)]

表2 各组1代小鼠血浆中催产素和血管加压素水平Tab.2 Levels of oxytocin and vasopressin in plasma of 1stgeneration mice in various groups [n=10,±s,ρB/(ng•L-1)]

Group Normal control 2% sevoflurane 2% sevoflurane +1% H2 2% sevoflurane +4% H2 Oxytocin 323.5±56.7 321.0±35.6 324.3±62.8 328.3±38.4 Vasopressin 693.2±42.9 697.1±54.5 695.6±41.0 687.7±55.8

2.3 各组孕鼠下丘脑内侧视前区组织中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表达水平Western blotting 法检测结果显示：各组1代小鼠下丘脑内侧视前区组织中c-Fos、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表达水平比较差异无统计学意义（P＞0.05）。见图1。

图1 Western blotting 法检测各组1代小鼠下丘脑内侧视前区组织中c-Fos、PARP1、cleaved PARP1、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.1 Electrophoregram(A) and histogram(B) of expressions of c-Fos, PARP1, cleaved PARP1, Caspase 3, and cleaved Caspase 3 proteins in medial preoptic area in hypothalamus tissue of 1st-generation mice in various groups detected by Western blotting method

3 讨 论

人类大脑快速发育的时期从妊娠后期到出生后数年，在啮齿类动物，该阶段从妊娠后期持续到出生后2周左右［10］。研究［11］显示：在神经突触发育的重要阶段接受某些麻醉剂，会引起神经元凋亡和抑制神经再生，从而导致认知和社会行为异常，这种异常甚至持续到动物成年。有研究［12］已经证实：哺乳动物新生期暴露于临床有效麻醉浓度的麻醉剂会导致大脑发育过程中出现广泛的神经元凋亡，进而造成成年后学习能力下降，尽管成年后神经元凋亡已经不明显。2016年，美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）［13］发表声明：怀孕母亲及儿童反复或持续接受麻醉药会阻碍新生儿神经发育，但其机制尚不清楚。目前儿童的七氟醚麻醉问题已逐渐成为关注的焦点，但极少有关于妊娠期七氟醚暴露群体的相关研究。有研究［14］表明：新生小鼠接受七氟醚麻醉后，不但可以导致学习障碍，而且可以引起反常的社会行为，比如自闭症谱系障碍，但其具体机制尚未阐明。

目前认为人类的母系行为表达和后代构建社会行为密切相关，母系行为缺失的母亲，其后代罹患精神疾病的概率增加［15-16］。母系行为的神经机制研究大部分集中在啮齿类动物，这种行为是一个极其复杂的社会行为任务［17］。

本实验结果表明：尽管在取回幼崽实验中，七氟醚组母鼠第1次去嗅幼崽时间明显长于正常对照组，同时，将幼崽取回放入窝内的时间也明显长于正常对照组，经H2作用处理后，母鼠第1次去嗅幼崽时间和将幼崽取回放入窝内的时间可明显缩短。由此可见七氟醚对小鼠的母系行为学造成了一定的影响，而且H2具有一定的保护作用。但是，最佳的评价模型和具体的作用机制仍未明确。

本实验检测下丘脑细胞凋亡指标，结果显示：各组1代小鼠下丘脑内侧视前区组织中c-Fos、PARP1、cleaved PARP、Caspase 3 和cleaved Caspase 3 蛋白表达水平比较差异无统计学意义；此外，小鼠血浆中催产素和血管加压素水平也未见显著变化。因此，暴露于临床剂量的七氟醚可能不会显著影响下丘脑内侧视前区细胞的凋亡情况，细胞凋亡也可能并不是七氟醚影响母系行为的机制。

近年来，除经典的细胞凋亡外，自噬死亡和铁死亡成为区别于细胞凋亡的新的死亡模式，在多个领域均产生了重要的影响［17-20］。因此，未见显著细胞凋亡的情况下，这些细胞死亡模式可能发挥重要的作用。进一步探讨小鼠下丘脑内侧视前区组织中自噬死亡和铁死亡的相关指标，有助于深入分析七氟醚影响母系行为学的机制。这些机制研究对于了解现代人类精神疾病的发生与胎儿期接受麻醉药物之间的关系、优化临床上对于孕产妇的麻醉剂使用情况和开发针对这一负面效应的药物具有重要的理论和实践意义。