重组人IL-17A 在胃癌组织中的表达及其对胃癌BGC-823 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响

母润红, 艾一玖, 李雨澎, 林 睿, 叶思萍, 马 方, 郭 笑，

（1.北华大学附属医院病理科，吉林 吉林 132013；2.北华大学基础医学院免疫学教研室，吉林 吉林 132013；3.北华大学药学院药学实验室，吉林 吉林 132013；4.吉化集团公司总医院病理科，吉林 吉林 132013）

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，探讨胃癌发生发展机制和新的治疗方案的研究一直备受关注。研究［1-2］显示：炎症与肿瘤的发生密切相关，在肿瘤微环境中，炎症通过诱导肿瘤组织遗传学改变，促进血管生成，促进肿瘤增大。白细胞介素IL-17（interleukin-17，IL-17）家族成员包含IL-17A～IL-17F 共6个成员，其中白细胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）是最受关注、最具有标志性的Th17 细胞因子，在慢性炎症和自身免疫性疾病的病理过程中起重要作用。研究［3］显示：IL-17 存在于多种炎症相关性肿瘤患者体内，并且IL-17A 对癌症起始过程中癌细胞的生长和转移起至关重要的作用，但其作用机制尚未明确。HUANG等［4］研究显示：IL-17A 可通过激活信号转导和转录激活因子1（signal transducer and activator of transcription 1，STAT1）和刺激肺腺癌生成血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）从而促进肿瘤血管生成；在结肠癌和肝癌组织标本中，IL-17A 表达水平升高与患者预后不良有关［5］；在患有卵巢癌的患者中发现IL-17A低表达与患者预后不良有关［6］；研究［7-8］显示：IL-17A 与鼻咽癌和肺癌的发生发展亦有关联。由此可见，IL-17A 对众多肿瘤的进展和治疗均可产生影响，然而目前IL-17A 与胃癌的关系尚未明确，关于其作用机制的研究较少。本研究首先检测IL-17A 在胃癌组织中的阳性表达率及其与白细胞介素17受体A（interleukin-17 receptor A ，IL-17RA）的相关性，观察IL-17A蛋白对胃癌BGC-823 细胞增殖、侵袭、迁移和凋亡的影响，进一步检测相关蛋白表达水平的变化，从新的角度揭示胃癌发病的免疫分子机制，为胃癌的诊疗提供新的思路。

1 资料与方法

1.1 临床资料收集2014年1月—2016年12月北华大学附属医院病理科30例原发性胃癌术后石蜡标本和20例肠上皮化生的胃组织标本，10例正常胃组织标本由吉化集团公司总医院病理科提供。胃癌患者男性16例，女性14例，年龄38～79岁，平均年龄为（64±3）岁。所有患者经病理学检测确诊且术前均未接受放化疗。

1.2 细胞、主要试剂和仪器人胃癌BGC-823 细胞株（北华大学基础医学院免疫实验室保存）。RPMI-1640和胎牛血清（美国Gibco公司），Lipofectamine®2000（美国Invitrogen 公司），RIPA裂解液（上海Beyotime 公司），抗人IL-17A 单克隆抗体（美国Novusiological 公司），抗人IL-17RA 单克隆抗体（美国Abcam 公司）和PV-6000 通用型免疫组织化学试剂盒（北京中杉生物公司）。Western blotting 电泳设备（美国Bio-Rad 公司），全自动酶标仪（美国Bio-Tek 公司）。

1.3 细胞培养将人胃癌BGC-823 细胞置于含10% 胎牛血清和1% 双抗的RPMI-1640 培养基中，于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养，每2～3 d 传代1次。

1.4 免疫组织化学染色和结果判定采用免疫组织化学法检测胃癌、肠上皮化生和正常胃组织 中IL-17A 和IL-17RA 的表达情况，采用Pearson 相关分析法分析3种组织中IL-17A 与和IL-17RA 表达的关系。制备石蜡标本切片，厚度为5 μm，参照试剂盒说明书步骤进行免疫组织化学染色，以PBS 作为阴性对照。双盲法判定染色结果，以细胞浆或细胞核显示棕黄色颗粒判定为阳性细胞，结果判定依照文献［9］。

1.5 MTT 法检测细胞增殖活性取对数生长期BGC-823 细胞，在96孔板中每孔加入100μL 培养液（8×104个/孔），37℃孵育过夜，分别加入不同浓 度（50、100 和200 μ g·L－1）IL-17A ，作为IL-17A组，对照组（0 μmol·L－1IL-17A）加入等体积DMSO，5个复孔，持续培养24、48 和72 h后取出培养板，向各孔加入10 μL MTT 溶液，继续孵育4 h，弃上清培养液。每孔加入200 μL DMSO。采用酶标仪于波长490 nm 处读取吸光度（A）值，以A 值表示细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线。

1.6 流式细胞术检测各组细胞凋亡率取对数生长期BGC-823 细胞，以每孔4×105个细胞的密度接种于12 孔板中，培养24h后，PBS 缓冲液洗涤2次，加 入50、100 和200 μ g·L－1IL-17A ，培 养48 h，混匀，取250 μL 细胞于标记好的流式管中，空白组调电压，采用ddH2O 稀释重悬细胞，流式管中轻轻加入1 μL FITC Annexin Ⅴ涡旋细胞，室温避光孵育10 min。另一单染组和实验组各加入1 μL PI 溶 液，随后采用100μL 1×Binding Buffer溶液重悬，轻轻涡旋，上机检测，最后采用FlowJo V10分析数据并绘图。

1.7 Transwell 侵袭实验和划实验检测各组侵袭细胞数和细胞迁移率Transwell 侵袭实验检测侵袭细胞数：细胞经48h分组处理后，采用胰蛋白酶消化制备单细胞悬液，取细胞密度为1×105mL－1，取200 μL 加入Transwell 上室，Transwell 下室加 入含10% 胎牛血清的完全培养基，培养24 h，多聚甲醛固定，结晶紫染色。200 倍视野镜下观察计数：选择5个区域检测侵袭细胞数，并取平均值。实验重复3次。划痕实验检测细胞迁移率：6 孔板中加入细胞密度为1×105个/孔，37℃、5% 细胞培养24h后，采用无菌移液器枪头做直线划痕，培养时间设为48 h，取出，拍照。细胞迁移率=（0h划痕宽度－48h划痕宽度）/0h划痕宽度×100%。实验重复3次。

1.8 Western blotting 法检测各组细胞中VGEF、基质金属蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）、B细胞淋巴 瘤2（B lymphocytoma-2，Bcl-2）和Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）蛋白表达水平各组细胞经胰蛋白酶消化后收集，采用预冷的PBS 缓冲液洗涤2次。加入100 μL RIPA裂解液，4℃、30 min 孵育，离心收集上清液。采用BCA 法测定细胞中总蛋白浓度，上样量为50 μg，以10% SDS-PAGE 电泳1 h，半湿转法将胶内蛋白质印迹到PVDF 膜上，含5% 脱脂奶粉的TBST 封闭膜室温放置1h。弃封闭液，加入抗体VEGF（1∶200）、MMP-9（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和Bax（1∶500）抗体于4℃孵育过夜。取出TBST 洗涤3次，加入HRP 辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000 ）室温孵育1 h。ECL 发光显色并拍照，以GAPDH 为内参对各组蛋白进行灰度值分析，每组蛋白重复3次。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS17.0 统计软件进行统计学分析。胃癌组织、肠上皮化生组织和正常胃组织中IL-17A 及IL-17RA阳性表达率，各组BGC-823 细胞增殖活性、细胞凋亡率、侵袭细胞数、细胞迁移率及细胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2和Bax 蛋白表达水平均符合正态分布且方差齐，以±s 表示，组间比较采用方差分析，组内两两比较采用SNK-q检验。胃癌组织中IL-17A 与IL-17RA 表达的相关性分析采用Pearson 相关分析法。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各种组织中IL-17A 和IL-17RA 阳性表达率免疫组织化学法检测结果显示：肠上皮化生组织和胃癌组织中IL-17A 阳性表达率分别为（6.289±1.274）% 和（9.494±1.808）%，较正常胃组织（1.945%±1.275%）均升高（P＜0.01）；肠上皮化生组织和胃癌组织中IL-17RA 阳性表达率分别为（3.883±1.184）% 和（8.836±5.569）%，较正常胃组织（2.886%±1.587%）均 升 高（P＜0.01）。在胃癌组织中IL-17A 和IL-17RA 主要表达于腺上皮、单核细胞和部分肿瘤细胞中。见图1。Pearson 相关分析结果表明：胃癌组织中IL-17A 和IL-17RA 的表达呈正相关关系（r=0.891，P＜0.01）。见表1。

表1 胃癌组织中IL-17A 与IL-17A 表达的相关性Tab.1 Correlation between expressions of IL-17A and IL-17RA in gastric cancer tissue

图1 不同组织中IL-17A 和IL-17RA 的表达（免疫组织化学,×200）Fig.1 Expressions of IL-17A and IL-17RA in different kinds of tissues（Immunohistochemistry,×200）

2.2 各组胃癌BGC-823 细胞增殖活性MTT 法检测结果显示：IL-17A 在50～200 μg·L－1范围内呈浓度依赖性促进胃癌BGC-823 细胞增殖。作用48 和72h后，与对照组（0 μg·L－1IL-17A组）比较，100 和200 μg·L－1IL-17A组 胃 癌BGC-823细胞增殖活性明显升高（P＜0.05）。见表2。

表2 各组胃癌BGC-823 细胞的增殖活性Tab.2 Proliferation activities of gastric cancer BGC-823 cells in various groups (n=3，xˉ±s）

2.3 各组胃癌BGC-823 细胞凋亡率流式细胞术检 测 结 果显示： 100 和200 μg·L－1IL-17A组胃癌BGC-823 细胞凋亡率分别为（20.15±2.10）%和（10.87±3.30）%，与对照组（37.30%±2.60%）比较明显降低（P＜0.05）。见图2。

图2 各组胃癌BGC-823 细胞凋亡率Fig.2 Apoptotic rates of BGC-823 cells in various groups

2.4 各组胃癌BGC-823 细胞侵袭细胞数Transwell 侵袭实验检测结果显示：随着IL-17A 浓度 升 高，BGC-823细胞侵袭数增加，100 和200 μg·L－1IL-17A组细胞侵袭数分别为（82.6±4.2）个和（113.4±5.8）个，对照组侵袭细胞数为（33.0±5.1）个，100 和200 μg·L－1IL-17A组细胞侵袭数高于对照组（P＜0.05）。见图3。

图3 Transwell 小室法检测各组胃癌BGC-823 细胞侵袭形态表现（结晶紫，×200）Fig.3 Invasion morphology of BGC-823 cells in various groups detected by Transwell assay（Crystal violet,×200）

2.5 各组胃癌BGC-823 细胞迁移率100 和200 μg·L－1IL-17A组细胞迁移率分别为（45.4±4.2）% 和（57.3±3.9）%，明显高于对照组（18.5%±3.2%）（P＜0.05）。各组胃癌BGC-823细胞迁移情况见图4。

图4 各组胃癌BGC-823 细胞迁移情况Fig.4 Migration of BGC-823 cells in various groups

2.6 2组胃癌BGC-823细胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2 和Bax蛋白表达水平与对照组比较，200 μg·L－1IL-17A组胃癌BGC-823 细胞中VEGF、MMP-9 和Bcl-2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05），Bax 蛋白表达水平明显降低（P＜0.05）。见图5 和表3。

表3 2组胃癌BGC-823 细胞中VEGF、MMP-9、Bcl-2 和Bax 蛋白表达水平Tab.3 Expression levels of VEGF,MMP-9,Bcl-2,and Bax proteins in gastric cancer BGC-823 cells in two groups(n=3，xˉ±s）

图5 2组胃癌BGC-823 细胞中VEGF、MMP-9、Bcl2和Bax 蛋白表达电泳图Fig.5 Eletrophoregram of expressions of VEGF,MMP-9, Bcl-2, and Bax proteins in gastric cancer BGC-823 cells in two groups

3 讨 论

慢性炎症是导致肿瘤发生发展的重要因素之一。研究［10-12］显示： 由CD4+T淋巴细胞产生促炎性因子IL-17，参与多种慢性炎症，通过与靶细胞膜表面受体IL-17R 结合，可激活下游通路，实现多种生物学效应。IL-17A 及其受体IL-17RA 在炎症、免疫性疾病和肿瘤进展过程中发挥重要作用，近年来受到广大科研工作者的关注。然而，IL-17A 在胃癌中作用的相关报道较少。本研究采用免疫组织化学法检测IL-17A 及其受体IL-17RA在胃癌组织中的表达，并将重组人IL-17A 作用于胃癌BGC-823 细胞，检测其对细胞增殖、迁移和侵袭的影响，初步探讨其可能的作用机制。

肿瘤的发生是一个多重因素介导的复杂过程，其中炎症因子可以通过不同途径影响肿瘤的发展和预后［13］。本研究结果显示： 与正常胃组织比较，IL-17A 及其受体IL-17RA在胃癌组织中表达明显增加，初步提示IL-17A 及其受体IL-17RA 可能参与了胃癌发展的进程。研究［14-18］显示：在前列腺癌组织中IL-17A 和IL-17RA mRNA表达水平升高；在结直肠癌和肝癌组织中，IL-17A 表达水平升高且患者预后不良；类似的结果也在鼻咽癌和宫颈癌相关研究中被发现，与本研究结果一致。因此一定条件下IL-17A 可以促进胃癌BGC-823细胞增殖、迁移和侵袭。吴振华［19］研究显示：IL-17A 及其受体IL-17RA 可于体外促进非小细胞癌细胞的侵袭及迁移能力；杨学良等［20］研究显示：IL-17A 通过调控信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）和磷酸化STAT3（ phosphorylated STAT3 ，p-STAT3）影响结肠癌细胞的生长；肖梓屾等［21］研究显示：IL-17A 可促进前列腺癌细胞的迁移。可见IL-17A在多种癌症的发生发展过程中均发挥作用。

本研究中流式细胞术检测结果显示：IL-17A作用于BGC-823 细胞后，IL-17A组细胞凋亡率较对照组明显降低。Bax 和Bcl-2 是一对调控细胞凋亡的关键因子［22］。本 研究 中Western blotting 法检测结果显示：IL-17A 蛋白作用于BGC-823 细胞后，抗凋亡蛋白Bcl-2 表达水平明显升高，促凋亡蛋白Bax 表达水平明显降低，提示IL-17A 可能是通过线粒体调控Bcl-2 和Bax 蛋白表达来抑制胃癌细胞的凋亡。本研究结果显示： IL-17A 作用于胃癌BGC-823 细胞后，细胞中VEGF 和MMP-9 蛋白表达水平升高。VEGF 作为血管生成的主要调节因子之 一，研究［22-23］显示：VEGF可以利用信号传导刺激癌细胞增殖；且VEGF 与胃癌细胞的增殖和转移存在明显正相关关系。MMP-9 水平异常升高在肿瘤的侵袭和转移发挥重要作用，研究［24］显示：MMP-9 在胃癌组织中高表达，并且促进胃癌细胞转移，可见IL-17A 在一定程度上是通过调控VEGF 和MMP-9 的表达进而促进胃癌细胞的增殖及迁移。

综上所述，IL-17A 及其受体IL-17RA 可能参与胃癌的发生发展过程；重组IL-17A 可能通过激活Bcl-2 和Bax 信号通路抑制胃癌细胞的凋亡；同时，通过调控VEGF 和MMP-9 的表达来促进胃癌细胞的增殖、迁移及侵袭，进而影响胃癌的进展。