黄芪甲苷对miRNA-1 过表达诱导大鼠心力衰竭的保护作用及其机制

黄 悦, 王秋宁, 杨雪峰, 陶贵周

（1.锦州医科大学附属第一医院心内科，辽宁 锦州 121000；2.锦州医科大学基础医学院生理实验室，辽宁 锦州 121000）;

心力衰竭（heart failure，HF）是各种心血管疾病发展的终末阶段［1］。HF 是全球范围内心血管疾病患者死亡的主要原因之一［2］。随着我国人口老龄化加剧，HF 的患病率持续升高，然而目前并无十分有效控制HF 症状的治疗方法［3］，寻找新的治疗靶点和药物非常重要。微小RNA（microRNA，miRNA）是调节内源性基因的一类短链非编码小RNA，通过与目的基因的mRNA 3′端非翻译区互补配对，形成RNA 沉默，在目的基因转录后负性调节其表达水平，从而调控机体各种生理病理过程［4］。miRNA-1 具有肌细胞特异性，且是心脏组织中表达丰度最高的miRNA，占心肌组织总miRNA的40%。miRNA-1 在HF［2］、心肌肥厚［5］和心肌梗死［6］等许多心血管疾病中表达异常。过表达的miRNA-1 可以引起小鼠心室重构，损伤心脏的收缩和舒张功能，导致HF［7］。研究［8］证实：下调miRNA-1 表达具有心脏保护作用。目前，miRNA-1已被认为是心血管疾病新的治疗靶点。

黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ，ASⅣ）是中药黄芪的主要活性成分之一，具有抗炎［9］、抗氧化［10］、抗细胞凋亡［11］和调节代谢［12］等多种药理作用，尤其是在心血管方面具有广泛的临床应用潜力。目前本课题组［13］已经明确ASⅣ对HF具有保护作用，但ASⅣ能否通过调节miRNA-1 表达来治疗HF 目前尚未见报道。本研究探讨ASⅣ对HF 的改善作用，为临床上应用ASⅣ防治心血管疾病提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物、细胞、主要试剂和仪器32只SD大鼠，7～8周龄，健康雄性，体质量（240±20）g，购自锦州医科大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK（辽）2016-0004。实验前适应性饲养1周，实验期间自由摄食和饮水。大鼠H9C2 心肌细胞购自上海名劲生物科技有限公司。ASⅣ（纯度≥98%）购自南京景竹生物科技有限公司，miRNA-1 mimics 购自上海吉凯基因科技有限公司，DMEM 培养基购自美国Gibco 公司，胎牛血清购自德国PAN-Biotech 公司，钙测试盒购自南京建成生物有限公司，实时荧光定量PCR（Realtime fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）测定试剂盒购自南京Vazyme 公司，钙离子／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calcium／calmodulin dependent protein kinaseⅡ，CaMKⅡ）和兰尼碱受体2（ryanodine receptor type 2，RyR2）单克隆抗体购自武汉ABclonal 公司，山羊抗兔IgG购自武汉Elabscience 公司。DP-50Vet 动物心脏超声检测仪器购自中国Mindray 公司，HERAcell150i CO2培养箱购自美国Thermo Scientific 公司，SW-CJ-1FD 超净工作台购自苏州安泰空气技术有限公司，StepOnePlus RT-qPCR 仪购自美国Applied Biosystems 公司，OPTIMA S/N 413-3921 酶标分析仪购自德国Bmg Labtech 公司。

1.2 实验分组和模型建立将32只SD 大鼠随机分为正常对照组、miRNA-1 mimics 阴性病毒对照（miRNA-1 mimics NC）组、miRNA-1 mimics组和ASⅣ+miRNA-1 mimics组，每组8只。正常对照组、miRNA-1 mimics NC组和miRNA-1 mimics组大鼠给予0.9% 生理盐水灌胃，ASⅣ+ miRNA-1 mimics组大鼠给予80 mg·kg－1ASⅣ灌胃，连续1周。灌胃结束后造模。采用10%水合氯醛［0.4 mL·（100g）－1］ 对大鼠进行腹腔注射麻醉，大鼠仰卧伸展四肢并固定，在大鼠左侧第3～4 根胸骨处剪开1个小口暴露心脏。在左心室壁上取3个点注射miRNA-1 慢病毒溶液，总剂量为10 μL（1×107mL－1），然后快速缝合和消毒。之后连续3 d 腹腔注射8万单位青霉素钠。ASⅣ+miRNA-1 mimics组大鼠继续80 mg·kg－1ASⅣ灌胃，连续2周，RT-qPCR 法结果显示miRNA-1 过表达视为转染成功，超声结果显示左心室射血分数（ejection fraction，EF）和左心室短轴缩短率（fraction shortening，FS）明显降低视为模型建立成功。

将H9C2 心肌细胞置于含10% 胎牛血清的DMEM 培养基中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，当细胞铺满培养皿80% 时，采用0.25% 胰酶消化传代。将H9C2 心肌细胞（8×104mL－1）和2 mL 常规培养基分别置入4只干净的25 cm2培养瓶中，分为正常对照组、miRNA-1 mimics阴性病毒对照（miRNA-1 mimics NC）组、miRNA-1 mimics组 和ASⅣ+miRNA-1 mimics组；20h后，ASⅣ+miRNA-1 mimics组心肌H9C2细胞加入ASⅣ溶液（10 μmol·L－1，ASⅣ溶于二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）预保护心肌 细胞；4h后，弃掉4组H9C2 心肌细胞的常规培养基，正常对照组H9C2 心肌细胞中加入新鲜常规培养基，miRNA-1 mimics NC组H9C2 心肌细胞中加入含有miRNA-1 mimics 阴性慢病毒的感染复数（multiplicity of infection，MOI）为3 的无血清培养基（含1% 青霉素/链霉素），miRNA-1 mimics组和ASⅣ+ miRNA-1 mimics组心肌H9C2 细胞加入含有miRNA-1 mimics 慢病毒（MOI 为3）的无血清培养基（含1% 青霉素/链霉素），ASⅣ组H9C2心肌细胞再加入ASⅣ；8h后，弃掉4组心肌H9C2细胞的常规培养基，加入新鲜常规培养基；72h后，收取细胞样品。以RT-qPCR 法结果显示miRNA-1 过表达视为转染成功。

1.3 RT-qPCR 法检测各组大鼠心肌组织和H9C2心肌细胞中miRNA-1 表达水平按照试剂盒说明书提取各组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞总RNA，逆转录生成cDNA 后进行RT-qPCR 检测，引物序列见表1。设置反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，采用2－ΔΔCt法计算miRNA-1表达水平。

表1 miRNA-1 引物序列Tab.1 Primer sequences of miRNA-1

1.4 超声心动图检测各组大鼠EF 和FS采用10% 水合氯醛腹腔注射进行麻醉后，将大鼠四肢伸展仰卧固定，暴露前胸。采用脱毛工具将大鼠左侧胸毛去除干净，并均匀涂上超声耦合剂。将超声探头置于大鼠左心室长轴切面，显示左心室长轴二维超声心动图，引出M 型曲线并进行测量，每组取3个连续心动周期测量的平均值。检测各组大鼠EF 和FS。

1.5 MTT 法筛选ASⅣ的最适给药浓度和细胞存活率取对数生长期的H9C2 心肌细胞，以5×104mL－1密度接种于96 孔板，按照分组进行药物和转染处理，其中ASⅣ+miRNA-1 mimics组H9C2心肌细胞分别采用4、6、8、10 和12 μmol·L－1ASⅣ预处理，弃去原培养基，加入10 %MTT 新鲜培养基，于培养箱中孵育4h后弃上清，加入150 μL DMSO 于细胞培养箱中继续孵育15 min，采用酶标仪在490 nm 波长处检测各孔吸光度（A）值，计算细胞存活率。细胞存活率=实验组A 值/正常对照组A 值×100 %。

1.6 各组H9C2 心肌细胞中Ca2+水平检测H9C2心肌细胞采用胰酶消化，培养液室温1 000 r·min－1，离心10 min，弃去上清。细胞沉淀中加入1 mL 等渗PBS 缓冲液混匀，室温1 000 r·min－1，离心10 min，弃去上清，重复1～2次。采用裂解液将细胞沉淀制成细胞匀浆。取10 μL 细胞匀浆，加入9 倍体积的去离子水，冰水浴匀浆，2 500 r·min－1离心10 min，取10 %匀浆上清液待测。按照钙测试盒说明书的分组采用酶标仪检测出各组细胞的A 值，计算细胞中Ca2+水平。细胞中Ca2+水平=（测定A值－空白A值）/（标准A值－空白A值）×标准品浓度/待测样本蛋白浓度。

1.7 RT-qPCR 法检测各组H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ和RyR2 mRNA 表达水平H9C2 心肌细胞按照试剂盒说明书提取总RNA，逆转录生成cDNA后进行RT-qPCR检测，通过引物分析mRNA 表达水平。反应条件：95℃预变性1 min；95℃变性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环，采用2－ΔΔCt法计算CaMKⅡ和RyR2 mRNA表达水平。CaMK Ⅱ和RyR2 引物序列见表2。

表2 CaMKⅡ和RyR2 引物序列Tab.2 Primer sequences of CaMKⅡand RyR2

1.8 Western blotting 法检测各组H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ和RyR2 蛋白表达水平提取各组细胞总蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒检测细胞中蛋白表达水平。按照相应比例配好浓缩胶和分离胶然后上样，SDS-PAGE 电泳（80 V、10 min，120 V、80 min），湿转法（60 V、90 min）转至PVDF 膜上，PVDF 膜放置5 %脱脂奶粉封闭1 h，加入一抗CaMK Ⅱ（1∶3 000）、RyR2（1∶3 000）和GAPDH（1∶3 000），4℃孵育过夜；TBST 清洗PVDF膜3次，5 min，室温下二抗孵育1 h；采用ECL 对蛋白显色，Image Lab 进行显影和Image J进行灰度值分析。以GAPDH 作为内参蛋白，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/GAPDH 条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析。各组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平，各组大鼠EF和FS值，各组大鼠H9C2 心肌细胞存活率，各组大鼠H9C2 心肌细胞中miRNA-1 和Ca2+水平，各组大鼠H9C2心肌细胞中CaMKⅡ和RyR2 mRNA 及蛋白表达水平均符合正态分布，以±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平明显升高（P＜0.01）；miRNA-1 mimics组大鼠心肌组织和心肌H9C2 细胞中miRNA-1 表达水平分别约是miRNA-1 mimicsNC组的6倍和82 倍；表明miRNA-1 mimics 过表达转染成功。与miRNA-1 mimics组比较，ASⅣ+miRNA-1 mimics组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平明显降低（P＜0.01）。见表3。

表3 各组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平Fig.3 Expression levels of miRNA-1 in myocardium tissue and H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups(n=4，±s）

表3 各组大鼠心肌组织和H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平Fig.3 Expression levels of miRNA-1 in myocardium tissue and H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups(n=4，±s）

*P＜0.01 compared with miRNA-1 mimics NC group；△P＜0.01 compared with miRNA-1 mimics group.

Group Normal control miRNA-1 mimics NC miRNA-1 mimics ASⅣ+miRNA-1 mimics Expression level of miRNA-1 Myocardium tissue 1.00±0.00 0.95±0.28 5.81±0.48*2.95±0.69△H9C2 cells 1.00±0.00 7.08±1.12 82.51±4.14*20.38±1.53△

2.2 各组HF 大鼠左心室EF 和FS与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠左心室EF和FS明显降低（P＜0.01），表明大鼠HF建立成功；与miRNA-1 mimics组比较，AS Ⅳ+miRNA-1 mimics组大鼠左心室EF 和FS 明显升高（P＜0.01）。见图1 和表4。

表4 各组大鼠左心室EF 和FSTab.4 EF and FS of left ventricle of rats in various groups(n=4，x±s，η/%）

图1 各组大鼠心功能超声心动图Fig.1 Echocardiography of cardac function of rats in various groups

2.3 各组大鼠H9C2心肌细胞存活率与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠H9C2心肌细胞存活率明显降低（P＜0.01）。与miRNA-1 mimics组比较，AS Ⅳ+ miRNA-1 mimics组大鼠H9C2心肌细胞存活率明显升高（P＜0.01），10 μmol·L－1ASⅣ+ miRNA-1 mimics组大鼠H9C2心肌细胞存活率明显高于4、6、8 和12 μ mol·L－1AS Ⅳ+ miRNA-1 mimics组（P＜0.01），因 此10 μmol·L－1ASⅣ为最适给药质量浓度。见图2。

图2 各组大鼠H9C2 心肌细胞存活率Fig.2 Survival rates of H9C2 cardiomyoctyes of rats in various groups

2.4 各组大鼠H9C2 心肌细胞中Ca2+水平与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠H9C2 心肌细胞中Ca2+水平明显升高（P＜0.01）。与miRNA-1 mimics组比较，AS Ⅳ+miRNA-1 mimics组大鼠H9C2心肌细胞中Ca2+水平明显降低（P＜0.01）。见图3。

图3 各组大鼠心肌H9C2 细胞中Ca2+水平Fig.3 Expression levels of Ca2+in H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups

2.5 各组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMK Ⅱ和RyR2 mRNA 表达水平与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMK ⅡmRNA 表达水平明显升高（P＜0.01），RyR2 mRNA 表达水平明显降低（P＜0.01）。与miRNA-1 mimics组比较，ASⅣ+miRNA-1 mimics组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMKⅡmRNA 表达水平明显降低（P＜0.01），RyR2 mRNA 表达水平明显升高（P＜0.01）。见图4。

图4 各组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ（A）和RyR2 (B)mRNA 表达水平Fig.4 Expression levels of CaMKⅡ(A) and RyR2(B) mRNA in H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups

2.6 各组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ和RyR2蛋白表达水平与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMK Ⅱ蛋白表达水平明显升高（P＜0.01），RyR2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。与miRNA-1 mimics组比较，ASⅣ+miRNA-1 mimics组H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），RyR2 蛋白表达水平明显升高（P＜0.01）。见 图5 和6。

图5 各组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ和RyR2 蛋白表达电泳图Fig.5 Electrophoregram of expressions of CaMK Ⅱand RyR2 proteins in H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups

3 讨 论

HF 是心脏结构和（或）功能异常改变导致心室心肌收缩和舒张功能障碍的疾病。本实验通过对大鼠左心室转染miRNA-1 的方法建立大鼠HF 模型［14］。本研究结果显示：与miRNA-1 mimics NC组比较，miRNA-1 mimics组大鼠EF 和FS 明显降低，说明过表达的miRNA-1 能损伤大鼠左心室收缩功能，导致HF。这与ZHANG 等［14］研究结果一致，说明通过该方法建立HF 模型是可行的。

ASⅣ具有药效温和稳定、不易产生耐药性和药物不良反应较少等特点，临床上常被用于心血管疾病的治疗［15］。本研究结果显示： 与miRNA-1 mimics组 比 较，AS Ⅳ+miRNA-1 mimics组大鼠H9C2 心肌细胞中miRNA-1 表达水平明显降低，EF 和FS 明显升高，说明ASⅣ可改善HF 大鼠心脏功能和心肌损伤，其心脏保护作用的机制是通过下调miRNA-1 表达实现的。本研究结果为临床上应用ASⅣ防治心血管疾病的发生发展提供了实验依据并拓宽了思路。本课题组进一步探讨了ASⅣ保护心肌细胞对抗miRNA-1 过表达诱导的心肌细胞损伤的具体作用机制。

图6 各组大鼠H9C2 心肌细胞中CaMKⅡ(A) 和RyR2(B)蛋白表达水平Fig.6 Expression levels of CaMK Ⅱ(A) and RyR2(B) proteins in H9C2 cardiomyocytes of rats in various groups

HF 的发病机制十分复杂，涉及神经内分泌［16］、心肌细胞凋亡［17］和心肌细胞中Ca2+循环异常［18］等，特别是心肌细胞中Ca2+水平变化可直接引起心肌收缩和（或）舒张功能的异常。因此抑制心肌细胞中Ca2+超载对于保护心肌十分重要［19］。RyR2 和CaMK Ⅱ均是心肌细胞中重要的钙调蛋白［20］。RyR2是心肌肌质网（sarcoplasmic reticulum，SR）上广泛分布的调控Ca2+释放的核心通道；CaMKⅡ是细胞中Ca2+信号传导者，可以使底物磷酸化从而调节心肌细胞中Ca2+水平的变化［21］。研究［22］显示：CaMKⅡ可以介导RyR2 S2814 位点的磷酸化。蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A，PP2A）是丝氨酸苏氨酸磷酸化酶，可以调节RyR2在CaMK ⅡS2814位点的磷酸化状态［23］。ALI等［24］发现：PP2A 的调节亚基B56α 是miRNA-1的靶点。TERENTYEV 等［25］在miRNA-1过表达的大鼠心肌细胞中发现：miRNA-1 通过转录后水平抑制PP2A 调节亚基B56α 表达，增强RyR2 在CaMKⅡS2814 位点磷酸化，激活SR 上的RyR2 通道释放大量Ca2+，导致心肌细胞中Ca2+水平明显升高，诱导心脏电生理紊乱。CaMKⅡ抑制剂KN93 可以抑制miRNA-1 表达，逆转上述结果。由此可见，miRNA-1 可调控CaMKⅡ介导RyR2 的磷酸化。

本研究结果证实：miRNA-1 过表达可诱导心肌细胞中Ca2+超 载，与TERENTYEV 等［25］研究结果一致，且下调miRNA-1 表达可减轻心肌损伤［8］。本研究结果显示：与miRNA-1 mimics组比较，AS Ⅳ+miRNA-1 mimics组大鼠心肌细胞中miRNA-1 表达水平和胞浆中Ca2+水平明显降低，同时心肌细胞中CaMKⅡ蛋白表达水平明显降低，RyR2 蛋白表达水平明显升高，提示ASⅣ可有效抑制心肌细胞中miRNA-1 表达，并通过miRNA-1 调控CaMKⅡ介导RyR2 的磷酸化改善心肌细胞中钙超载造成的心肌损伤。

本研究在结果证实： AS Ⅳ可以通过抑制miRNA-1 表达改善HF 引起的心肌收缩功能障碍和心肌损伤，其机制可能是通过下调miRNA-1 来调控CaMKⅡ介导RyR2 的磷酸化，从而改善心肌细胞中Ca2+超载造成的心肌损伤。