全自动氨基酸分析仪法同时测定复方α-酮酸片中的5种氨基酸含量

(烟台市食品药品检验检测中心，烟台 264000)

复方α-酮酸片为多种酮酸、羟酸及氨基酸组成的复方制剂，临床上主要用于治疗慢性肾功能衰竭、延缓肾衰进展、纠正代谢紊乱等。对于慢性肾衰患者，服用复方α-酮酸片可以有效的增加营养，改善糖尿病肾病患者的肾功能，对血糖、血压水平具有一定的控制作用，安全性较好[1，2]。该药物的作用机理主要是通过减少饮食对蛋白的摄入，进而减少体内肌酐的合成速度，将非必需氨基酸转化成为必需氨基酸，从而达到辅助治疗的目的[3，4]。复方α-酮酸片中酮酸和羟酸以钙盐的形式存在，5种氨基酸分别为醋酸赖氨酸(lysine acetate，LYS)、苏氨酸(threonine，THR)、色氨酸(tryptophan，TRY)、组氨酸(histidine，HIS)、酪氨酸(tyrosine，TYR)。文献报道中，对于5种游离氨基酸的含量测定多使用柱前衍生化的方法，衍生试剂多采用2，4-二硝基氟苯(FDNB)、邻苯二甲醛(OPA)和 2-巯基乙醇等，衍生化试剂毒性大，衍生过程对于时间和温度的要求较为严苛，而衍生过程的优异直接影响氨基酸含量测定结果[5-10]的准确性。此外，国家药品监督管理局收载的国家药品标准中对于复方α-酮酸片中五种氨基酸的含量测定的方法描述，存在步骤复杂并需使用高性能的液相色谱仪、或描述简略、或无法同时测定五种氨基酸成分等问题[11-13]。目前，随着检验检测技术的进步，全自动氨基酸分析仪法因其自带衍生系统，大大简化了样品的处理步骤，有效降低了处理过程中产生的误差，该技术已广泛应用于食品检验、临床检验等方面[14-19]，但在药品检验行业还需进一步扩大和深入。文献报道中对于复方α-酮酸片的测定多采用HPLC法、虽能同时测定5种氨基酸的含量，但实验过程中需使用剧毒性的衍生试剂进行衍生化操作，风险较大[7-10]。本试验建立的氨基酸分析仪的测定方法，消除了各样品由于衍生时间和温度等因素的差异带来的误差，不但能够同时测定复方α-酮酸片中的5种氨基酸含量，而且还具有简单、快速、衍生剂不直接进柱等优点。

1 仪器和试剂

1.1 仪器

XPE205DR电子分析天平；S-433D氨基酸分析仪，包括自动进样系统、泵系统、温控分离及柱后衍生系统、检测系统、工作站等；层析柱：阳离子交换色谱柱 LCA K07/Li(4.6×150mm)。

1.2 试剂

醋酸赖氨酸对照品(批号:140802-202003，含量99.8%)、色氨酸对照品(批号：140686-201904，含量99.9%)、苏氨酸对照品(批号：140682-201302，含量99.9%)、盐酸组氨酸对照品(批号：140693-201904，含量99.9%)、酪氨酸对照品(批号：140609-201914，含量99.9%)均购自某食品药品检定研究院；17种氨基酸混标液(批号：SLBZ9656)；茚三酮(货号：S000027CN)购自科学仪器公司。其他试剂均为分析纯试剂。复方α-酮酸片：药业公司(批号：52006015，薄膜衣片，规格：每片0.63g)；复方α-酮酸片：医药公司(批号：81PA008、81PC087，薄膜衣片，规格：每片0.63g)。

2 方法和结果

2.1 测定条件

氨基酸分析仪的流动相：A相为柠檬酸锂(0.12 N，pH 2.90)、B相为柠檬酸锂(0.2 N，pH 4.20)、C相为柠檬酸锂(0.3 N，pH 8.00)，D相为锂再生液(0.45 N/Li)；流速：缓冲泵0.45 mL/min，缓冲泵的梯度洗脱程序为：0 min：80% A + 20% B；3 min：79% A + 21% B；8 min：61% A + 39% B；20 min：43% A + 57% B；32 min：100% B；38 min：100% C；43 min：76% C + 24% D；57 min：76% C + 24% D；57.10 min：100% D；61.10 min：100% D，61.20 min：100% A；73 min：100% A。

柱温箱温度程序为：0 min：42 ℃；25 min：42 ℃；40 min：60 ℃；46 min：74 ℃；62 min：74 ℃；68 min：42 ℃；73 min：42 ℃。

茚三酮衍生泵流速为0.25 mL/min，时间为60 min，反应器温度为130 ℃。

检测器为紫外检测器，波长为570 nm和440 nm。进样量50 μL。

2.2 溶液的制备

对照品溶液的制备 分别取醋酸赖氨酸对照品、苏氨酸对照品、色氨酸对照品、盐酸组氨酸对照品、酪氨酸对照品，精密称定，加20 mol·L-1的盐酸溶液溶解并稀释制成浓度为醋酸赖氨酸1065.1 mg·L-1、苏氨酸586.2 mg·L-1、色氨酸244.0 mg·L-1、组氨酸386.3 mg·L-1、酪氨酸300.7 mg·L-1的混合对照品储备溶液。精密量取2 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的盐酸溶液至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备 取本品适量，研细，精密称取细粉10.52 mg，置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的盐酸溶液至刻度，摇匀作为供试品储备溶液。精密量取2 mL置10 mL量瓶中，加20 mol·L-1的盐酸溶液至刻度，摇匀，作为供试品溶液。

空白辅料溶液：按处方精密称取不含上述5种氨基酸的空白辅料，置100 mL容量瓶中，加20 mol·L-1的盐酸溶液60ml，超声15 min，放冷，用20 mol·L-1的盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。

2.3 系统适用性及专属性试验

分别取2.2节的对照品溶液、混合标准品溶液、供试品溶液按2.1节的色谱条件，进样测定，记录色谱图，见图1。从图1A、B可以看出，在2.1所示色谱分析条件下，混合对照品中的五种氨基酸和供试品中的五种氨基酸均能实现基线分离，且分离度均大于1.5。图1C显示，空白辅料中不存在干扰峰，可见本品的其它组份及试剂对测定无干扰。结果表明，在该氨基酸分析仪的分析条件下，其他成分对复方α-酮酸片中的5种氨基酸成分的含量测定无干扰，表明所用方法的专属性良好 。

图1 复方α-酮酸片及氨基酸混标溶液的图谱1.混合对照品溶液；B.供试品溶液；C.空白辅料

2.4 线性关系考察

取2.2中的混合对照品储备液，分别精密量取0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL置100 mL量瓶中，加20 mol·L-1的盐酸溶液稀释至刻度。按2.1的测定条件进行测定，记录色谱图峰面积，以峰面积(Y)对各组分的进样量(X，mg·L-1)进行线性回归，利用最小二乘法计算所得的回归方程见表1。

表1 5种氨基酸的线性回归方程统计

2.5 精密度考察

精密吸取2.2中的对照品溶液，按2.1的测定条件进行测定，连续进样6次，记录色谱图，测得的各氨基酸的峰面积平均值和相对标准偏差见表2。表中数值显示，6次测量的峰面积的精密度均在0.3% ～ 0.5%之间，符合《中国药典》2020版关于方法精密度的要求。

表2 5种氨基酸混合对照品溶液的精密度测试结果(n=6)

2.6 重复性和重现性考察

取同一批号的复方α-酮酸片(批号81PA008)，按照2.2的方法，平行制备6份供试品溶液，分别按照2.1的测定条件进行测定。测得该批供试品中各氨基酸的结果如下：醋酸赖氨酸的平均含量为101.3%，RSD为1.2%；苏氨酸的平均含量为99.8%，RSD为0.6%；色氨酸的平均含量为98.0%，RSD为1.6%；组氨酸的平均含量为102.9%，RSD为0.8%；酪氨酸的平均含量为98.0%，RSD为0.6%。请另一名试验人员精密称取同批次复方α-酮酸片，按照2.2的方法平行制备6份供试品溶液，按照2.1的测定条件进行测定，测得醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸的平均含量分别为：100.4%、99.6%、98.1%、102.6%、98.4%；RSD(n=6)分别为1.3%、0.5%、1.2%、0.6%、0.4%，均小于2.0%，重现性良好。

2.7 稳定性试验

精密吸取同一批号(81PA008)的复方α-酮酸片，按照2.2的方法配制供试品溶液，分别于配制后 0、2、4、8、16、24 h 进行测定，测得醋酸赖氨酸、苏氨酸、色氨酸、组氨酸、酪氨酸的平均峰面积分别为7923.094、6515.556、1375.456、3483.213、2279.894；RSD分别为0.6%、0.4%、0.8%、0.5%、0.2%。结果表明，供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 回收率试验

采用加样回收试验进行回收率测定，精密量取已知准确含量的同批供试品储备液9份，每份各精密量取2 mL，每3份分别按“1.2∶1，1∶1，0.8∶1”的比例，精密加入适量的氨基酸对照品储备溶液。计算回收率，结果见表3。利用该方法进行氨基酸测定时，复方α-酮酸片中5种氨基酸的平均回收率及RSD分别为：苏氨酸平均回收率99.3%，RSD为1.4%；酪氨酸平均回收率102.9%，RSD为2.0%；组氨酸的平均回收率为98.2%，RSD为1.5%；色氨酸的平均回收率为101.9%，RSD为1.2%；醋酸赖氨酸的平均回收率为99.1%，RSD为1.0%。

表3 复方α-酮酸片中5种氨基酸的回收率试验结果(n=9)

续表3

2.9 样品的含量测定

取3批样品，按2.2的方法制备供试品溶液和对照品溶液，按照2.1的方法进行测定，记录色谱图，以峰面积按外标法进行计算，结果见表4。

表4 样品含量测定结果(n=3)

3 讨论

本研究建立了氨基酸分析仪法同时测定复方α-酮酸片中5种氨基酸的分析方法。该方法不再使用高剧毒的衍生化试剂、也不需要采用柱前衍生的自动进样操作；操作简单方便、效率高、成本低。

方法学试验结果表明该方法对5种氨基酸能够实现完全的基线分离，专属性强、重复性好，且不受其他成分，如操作中带入的碳水化合物等的干扰。结果准确可靠，精密度与线性关系均良好，可用于复方α-酮酸片的质量控制。