视网膜母细胞瘤动物模型建立方法的研究进展

李 韵，李 娜(综述)，李 恒，白梦天*(审校)

(1.四川省遂宁市中心医院肿瘤中心，四川 遂宁 629000;2.四川省遂宁市中心医院眼科中心，四川 遂宁 629000)

视网膜母细胞瘤(retinoblastoma,RB)是幼儿常见的眼内恶性肿瘤。在发达国家，超过90%的RB患儿可获得良好预后且具备良好的视功能，我国RB患儿的长期生存率仅有63%，而在其他落后国家与地区，RB患儿病死率竟高达50%～70%[1]。迫切地需要建立统一规范的早期诊断策略与有效的治疗方案，以期降低全球RB患儿平均病死率、延长生存时间以及改善视功能。动物模型不仅在促进深入认识RB发病机制与分子遗传学上发挥了重要作用，也为RB的早期诊断及治疗方案的不断优化提供了有力的保障。构建RB动物模型需考虑模型的有效性、遗传性、生物稳定性、宿主动物内的免疫原性、系统的可预测性、可重复性以及模型动物的生存时间等问题[2-3]。当前，RB动物模型的构建方式主要有三种：①异种植入的移植瘤RB模型；②转基因的RB模型；③基因敲除RB模型。然而，目前尚没有一种造模方法能够完美地模拟人类RB的发生及发展，不同动物模型均存在各自的特点及局限性。因此，笔者将对异种植入的移植瘤RB模型、转基因的RB模型、基因敲除RB模型进行综述。

1 异种植入的移植瘤RB模型

目前，已有多种构建RB移植瘤动物模型的方法被报道。常用的模型动物为小鼠、新生SD大鼠、斑马鱼及新西兰白兔等，而严重联合免疫缺陷小鼠(severe combined immunodeficiency mice，SCID mice)成功率较高(68.8%)[4]。此外，由于兔眼同人眼具有相似的容积，因此兔眼常用于RB移植瘤影像学研究。目前，最常用的RB细胞注射方法为前房注射、玻璃体腔注射以及视网膜间隙下注射。使用前房注射RB细胞操作简单，且能较好地观察和取材肿瘤，但前房的物理和免疫环境均不同于眼后段[5]。尽管采用视网膜下间隙注射法可确保RB细胞在眼后段生长，但该法技术要求高，肿瘤不易直接观察，常需构建荧光蛋白进行示踪[6]，且在操作中极易损伤脉络膜和视网膜。近年来，Xiong等[7]采用皮下注射法构建模型，该法造模方法简单，操作风险低，但常引起视网膜之外的肿瘤发生。而玻璃体腔注射法操作相对简单，可较好地模拟肿瘤生长环境，并且观察肿瘤相对方便，因此成为目前运用最广泛的方式[5]。

McFall等[8]将Y-79和WERI-RB细胞分别注入经免疫抑制后的兔眼的前房中，成为最早成功构建RB移植瘤模型的研究者之一。Chévez-Barrios等[9]进一步研究发现，不同于WERI-RB细胞，Y-79细胞更易经视神经向脑部转移。目前普遍认为，移植瘤模型RB细胞的生长部位取决于肿瘤细胞注射的部位。但Lemaitre等[4]发现，采取玻璃体腔注射后肿瘤生长更快，而即使将RB细胞注射于视网膜下间隙，RB细胞也易侵入玻璃体腔生长，因此他们认为采取玻璃体腔注射可与视网膜下注射取得相似的RB动物模型。模型动物经放射、胸腺切除或药物处理致其免疫系统受损，使得移植瘤模型成功率上升[10]。而直接使用裸鼠和SCID小鼠不仅可免于对模型动物免疫系统的破坏，还能最大限度地保持RB细胞的组织学和生物完整性[11]。RB细胞注射后2周可见视网膜生长白色肿块，注射后3～5周RB侵入玻璃体及前房，病理下可见大量RB细胞浸润[5]。

异种植入移植瘤模型造模方式相对简单，经济成本相对较低，是目前构建RB动物模型使用最广泛的方法。此外，该模型直接将人类RB细胞进行移植，可重复性好，肿瘤组织学特性以及对药物的反应性更加接近人类RB患者[12-13]，因此成为可快速有效地筛选潜在药物的模型。

2 转基因的RB动物模型

视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRB)是相对分子质量为105 000的磷酸蛋白，属于“囊袋蛋白”家族[14]。具有DNA病毒蛋白谱的pRB复合物又被称为病毒癌蛋白(viral oncogene)，主要包括腺病毒5型癌蛋白、猿猴病毒40T抗原(simian virus 40 large T-antigen,SV40-Tag)、人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)16型和18型的E7蛋白[15]。该类病毒可将自身DNA整合至宿主细胞的基因组从而转化细胞，因此，常用于RB转基因动物模型的构建。将外源性DNA序列以非同源重组的方式与启动子耦合后微注射至受精卵中，并将其转移至假孕的雌鼠子宫内，则一部分子代可携带和稳定表达转基因性状，并将该性状稳定地向后代传递，由于转基因RB小鼠具有较好的自发性，因此常作为模型动物。

在转基因RB动物模型中，常以SV40-Tag作为启动子标记基因。Windle等[16]将SV40-Tag与黄体生成素β-T抗原(luteinizing hormone β-Tantigen,LHβ-Tag)共杂交，成功构建了第一个RB转基因小鼠模型。该研究发现被标记基因在垂体前叶分泌的促性腺激素中持续表达，并在5个月后形成双侧性RB。SV40基因组在大T区和小T区具有癌基因表达，均通过与P53、pRB家族结合而引起组织的肿瘤发生。该肿瘤亦表现出内生性和外生性，其不断向玻璃体腔、视网膜、脉络膜以及视神经进展[17]。此外，以视黄醛受体结合蛋白启动子标记的RB转基因动物则多表现为神经元特性，电镜下观察5月龄小鼠可见与人类RB常见的F-W蔷薇花(Flexner-winterstainer)型和H-W蔷薇花(Homer-Wright)型[18-19]。HPV E6可与P53结合从而抑制其功能，而HPV E7则与pRB、P107、P130结合而将其降解。运用HPVE6和HPVE7的靶向结合构建的动物模型为研究RB发生机制提供了独特的方式[20]。

Tag转基因模型已成为研究RB发生的重要工具。然而，病毒癌基因蛋白与其他组织蛋白的相互作用机制尚不清楚，因此其肿瘤发生的特异性低于移植瘤模型。

3 基因敲除(knockout，KO)RB模型

KO动物模型以小鼠多见，其通过同源重组技术，将外源基因与靶向基因载体相结合，而使靶向基因被替换或功能丧失，KO技术极大地推动了RB动物模型的发展。但早期RB KO小鼠多表现为中枢神经系统(central nervous system，CNS)肿瘤而非RB，视网膜则多表现为异位有丝分裂以及大量细胞变性[21]。当时已有研究者认识到P107可在RB1失活时发挥抑癌作用[22]。MacPherson等[23]发现新生乳鼠视网膜缺乏RB1时，P107表达持续上调。但同时缺乏RB1、P107及P53的小鼠并不会产生光感受器的恶变，通过构建巢蛋白、Chx10、Pax6启动子以选择性敲除视网膜组蛋白，于3～9个月后，在视网膜出现肉眼可见的肿瘤团块。其中，巢蛋白-Cre KO小鼠可见双侧RB，且组织结构和人类RB类似，并向眼外肌和视神经侵犯[24]。

RB1/P107双敲除(double knockout，DKO)小鼠的视网膜细胞出现大量凋亡表型，但仍有众多水平细胞和无长突细胞存活，但并未检测到RB细胞凋亡[25]。这与人类RB发生及其相似。在RB/P130 DKO模型中，出现肿瘤发生延迟和较低的外显率。而P130在视网膜的发育、细胞周期调控与肿瘤抑制方面均发挥了重要作用[26]。RB1/P107和RB/P130 DKO RB模型均可见RB细胞沿视神经侵犯脑部，这与人类RB的转移方式具有相似性[27]。

RB KO动物模型肿瘤发生于人类RB患者相似，该模型使得人类RB的生物学特征在动物模型上得到很好的重现[28]。此外，RB KO模型可较好地模拟人类RB的发生和转移。与移植瘤模型相比，RB KO模型肿瘤生物力学、肿瘤微环境、肿瘤的侵袭和转移以及对肿瘤治疗策略的筛选更为可靠[29]。

4 小结与展望

人类RB的发生不仅受到机体的调控，也与生活和工作环境、饮食习惯密切相关，尽管RB动物模型的构建有不同方式，但均存在局限性。移植瘤模型动物多存在免疫抑制甚至免疫缺陷，肿瘤也并非原发性，移植部位也并非人类RB生长部位。而Tag转基因模型操作较复杂、困难，造模预算较高且无法表现出人类RB的局灶性和克隆性。同移植瘤相比，RB KO模型的被敲除基因调控机制复杂且肿瘤特异性相对较低且模型动物存在一定的死亡率。

由于肿瘤的发生及其复杂，如何构建特异性更高、肿瘤的生物学特征更接近人类RB的模型，仍需进一步探索。但通过动物模型，可明确RB的组织超微结构、生物学特征、信号通路转导以及分子之间交互作用等。此外，通过对动物模型不断深入研究，有望提高早期诊断与早期治疗的水平，亦是改善患儿视功能与延长生存期的重要临床前手段。通过RB动物模型寻找肿瘤发生初期具有高特异性的分子靶标对于早期诊断有重要意义。