含缬酪肽蛋白在肿瘤中的研究进展*

郭小菲，艾浩

1.天津市滨海新区塘沽妇产医院，天津 300450；

2.锦州医科大学附属第三医院，辽宁锦州 121001

含缬酪肽蛋白（VCP）又名p97，在酵母中叫CDC48，在果蝇中叫TER94［1］。近年来发现，其高表达与许多肿瘤的发生密切相关。本文就其在肿瘤中的研究进展做介绍。

1 VCP的结构

在第9p13-p12染色体上存在着一个可以编码可溶性蛋白的基因，它就是VCP，其分子量是97kDa。VCP最主要分布的地方是细胞的胞质中，其次有一部分存在于亚细胞器（高尔基体、内质网、线粒体）的细胞膜上，也有一小部分定位在细胞核，协助核染色质降解相关过程和核蛋白质量控制。VCP属于参与多种细胞活动的ATP酶家族中（AAA+）的一员，这一家族中所有成员的作用都是作为分子伴侣促进蛋白质折叠或展开［2］，利用ATP水解能组装成由两个同心环构成的一个稳定六聚体环，并且它的组装不依赖于核苷酸的存在，这一点不同于细菌的AAA+蛋白。其AAA组件是由一个螺旋形结构域和一个高度保守的RecA样的结构域组成，这一结构同其他的AAA+ATP酶结构相似。RecA样结构域的特征是在两个相邻子单元的接口处有一个核苷酸绑定位点，在这个结构中，精氨酸-指残留物通过参与ATP r-磷酸化能促进核苷酸水解。此外，活化位点还包含经典的WalkerA核苷酸结合位点和WalkerB核苷酸水解位点，二者的主要任务就是负责核苷酸的结合和水解。VCP主要由四个结构域构成：氨基端泛素结合域、两个ATP酶结构域和一个羧基端区域［3］。因其同时拥有两个AAA+ATP酶结构域（分别命名为D1结构域和D2结构域），故又称其为Ⅱ型AAA+ATP酶。两个ATP酶结构域（D1和D2）由一个短多肽链接器连接，D1结构域与氨基端结构域（主要识别底物和衔接分子）由另外一个链接器连接，D2结构域的羧基末端是一个含有40个氨基酸残基的短尾［4］。D1和D2结构域的共同特征是ATP水解不同步，这一特征和VCP的氨基端结构域与某些辅助因子和适配器的不对称结合有关。与VCP相互作用的蛋白质主要分为两类，一类是适配器，其主要功能是把VCP和特定的亚细胞器或底物连接在一起；另一类是辅助因子，因其通常具有酶活性，所以其主要功能是帮助VCP处理底物。尽管有一些蛋白质是通过羧基端尾与VCP结合，如PLAA/Ufd3、HOIP、PNGase和Ufd2［5-6］，但其发挥分子伴侣的作用主要是通过与其氨基端结构域结合，如Ufd1、p47、ataxin3和UBX等，其中UBX域是一个与泛素相关的80余个模块结构，存在于一个p97适配器家族中，被称为UBX蛋白质，由13个成员组成。VCP的功能与其辅助因子和适配器能够识别泛素偶联物有关，而其功能关键所在是整个VCP系统与泛素之间的相互作用。尽管在序列和结构上，D1和D2结构域是同源的，但二者的功能却不相同。例如：D1结构域参与VCP的六聚体组装，而D2结构域主要负责整个ATP酶的活性［7］。

2 VCP的功能

2.1 蛋白质稳态控制

（1）内质网相关降解：VCP在内质网相关降解通路中起到重要作用，内质网相关降解主要是清除在分泌途径中错误折叠的蛋白质，是一种进化了的高度保守的生物过程。错误折叠的蛋白质在内质网中会被运回到细胞质，然后在细胞质内再通过一系列的蛋白酶依赖的降解途径降解掉。在这一降解过程中，VCP起到重要作用，其将位于细胞质中的错误折叠的蛋白质糖基化或者泛素化，然后再通过26S蛋白酶体（一种蛋白水解复合物，可以降解泛素修饰过的蛋白质）降解，并能将泛素收回后再利用。目前，关于VCP在内质网相关降解中的调控模式尚未完全了解，有待进一步研究。（2）线粒体相关降解：Heo等［8］已经证明，VCP通过从线粒体外膜摄取多肽来促进线粒体相关降解，这一过程消除了线粒体外膜的异常多肽，维持了线粒体蛋白质的稳态。此外，线粒体自噬的调控者（如线粒体融合蛋白）在转移到受损的线粒体时也可能被线粒体相关降解途径所破坏。当线粒体受损时，VCP和它的辅助因子（Ufd1，Npl4）会被招募到线粒体表面，这一过程是线粒体自噬清除受损线粒体时必不可少的［9］，即VCP及它的辅助因子受损时，会影响线粒体自噬清除受损线粒体这一过程。虽然目前已经知道VCP在线粒体调解过程中起到关键作用，但对于线粒体自噬或线粒体相关降解过程中招募VCP到线粒体表面的具体机制尚不清楚。Heo等［10］发现了一种叫VCP相关线粒体应激反应1（Vms1）的蛋白作为潜在的链接器，但其在线粒体相关降解中的作用仍存在异议。（3）核糖体相关降解：VCP参与停滞在核糖体上的异常新生多肽的降解过程，这一过程被称为核糖体相关降解（RAD）。当mRNA在翻译过程中有缺陷时（如终止密码子的缺失等），就会发生核糖体停滞。这种存在缺陷的mRNA会在翻译测试其保真度后被迅速分解［11］。因此，这个过程不可避免地与异常多肽的产生相关，而这些异常的多肽需要被有效清除，在这一过程中核糖体相关因子Rqc1会与VCP的泛素化底物结合，进而从核糖体中提取出有缺陷的多肽并将异常多肽转运到蛋白酶体进行降解。相反，当VCP与它的辅因子Ufd1和Npl4失活时就会导致60S核糖体复合物中的泛素蛋白的积累［12］。（4）染色质相关降解：VCP通过类似于内质网相关降解的方式从核染色质释放多肽，并在这一系列过程中与底物相互作用而发挥其功能，这一过程被称为染色质相关降解过程。目前已经确定的与VCP相互作用的底物有转录抑制因子a2、RNA聚合酶Ⅱ复合体、DNA复制许可因子CDT1、CMG DNA解螺旋酶、复制体组件Mcm7、DNA修复蛋白DDB2/XPC、Rad52和RNA结合蛋白［13］等，这些底物将VCP和各种核途径联系到一起，包括从基因转录到DNA复制与修复。

2.2 自噬

自噬属于一种应激适应过程，现有证据表明VCP参与了自噬过程。Krick等［14］在酵母菌中发现CdC48的适配器Shp1p与Atg8p（一个重要的自噬调控因子）相互作用，而Cdc48p和Shp1p的复合物也参与了大自噬。VCP也被证明在清除应激颗粒中积累的非翻译信使核糖核蛋白复合物中发挥至关重要的作用［15］。VCP同样也参与了细胞质聚集物的降解，其降解过程主要是通过聚集物自噬依赖途径降解。聚集物通过E3泛素连接酶形成多泛素化蛋白然后与HDAC6（一种动力蛋白复合物）形成聚合物并招募p62-NBR1-ALFY复合物形成自噬体和自噬溶酶体。研究已经证实VCP与HDAC6发生相互作用，VCP缺失或HDAC6缺失都会造成自噬溶酶体融合的缺陷。VCP失活时会导致自噬体的大量积累，而这些自噬体不能成熟为自噬细胞［16］。

2.3 膜融合

目前已知，VCP具有介导膜融合的作用，而且在减数分裂期高尔基体、内质网以及核膜的重新组装的过程中也需要VCP的参与。VCP在介导膜融合过程中，p47作为第一个发现的重要的辅助因子。它通过VCP与Syntaxin5连接。三聚体p47适配器在膜融合过程中起重要作用，在体外功能分析时发现，在有丝分裂的高尔基片段中重新组装高尔基体时加入p97/p47复合物是必需的，但是单加入p97是不够的。有研究已经证实［17］，p47参与了有丝分裂末期高尔基体和内质网的重组，p47的羧基端有两个VCP结合位点，其中一个就是UBX结构域。它的氨基端有一个UBA结构域与单泛素结合，对于高尔基体的重组很重要。另一个重要的辅助因子是VCIP135，被认为是p97/p47/syntaxin5-相互作用蛋白，它有一个UBX结构域，通过这个结构域可以与VCP结合，它也可以与VCP/p47/syntaxin5复合物结合并通过VCP催化的ATP水解反应。此外VCIP135也是体内高尔基体组装和ER交联形成所必需VCIP135，还具有去泛素化活性，是体外高尔基体重组所必须［18］。Syntaxin5（Syn5）是p97/p47介导的高尔基体重组的受体蛋白，p47介导p97与Syn5结合。在有丝分裂过程中NSF介导的高尔基体重组也有Syn5的参与，过渡期内质网膜的融合也需要Syn5的参与。

2.4 调控细胞周期

p97/p47通路参与细胞周期的调控，当细胞进入有丝分裂时，核膜破裂，p47进入胞质，同时CDC2激酶被有丝分裂激活后磷酸化。磷酸化的p47从高尔基体的细胞膜分离出来，导致p97/p47介导的膜融合受到抑制，最终高尔基膜破碎。在有丝分裂后期，去磷酸化的p47结合高尔基膜，使p97/p47介导的膜融合将高尔基体碎片重新组装。而当子细胞形成核膜时，p47移向细胞核导致p97/p47通路受抑制。对于p47的泛素化和去泛素化的调控是在其氨基端的UBA域，Catharina等［19］研究发现，VCP在人类U937白血病细胞周期的G0/G1发生阻滞，与蛋白和mRNA含量显著增加有关。

3 VCP与神经系统疾病

包涵体肌病、Paget疾病和额颞叶痴呆（IBMPFD）疾病是一种常染色体显性遗传性疾病，它会影响人的肌肉、大脑和骨骼。研究表明，其发生是由于VCP基因突变。到目前为止，在IBMPFD患者中已经发现，在VCP基因的29个不同位置有40多个突变，其中R155H突变是IBMPFD患者中最常见的突变，而A232E突变与最严重的临床表现密切相关。VCP突变会影响其在很多方面的功能，如许多突变会减弱D1结构域对ATP的亲和力，导致D2结构域ATP酶活性增加2～4倍［20］。突变后的VCP主要影响组织和器官，如肌肉和大脑的能量摄取。在细胞内，线粒体通过氧化磷酸化产生ATP并向组织提供能量。结构学研究表明，IBMPFD突变大多被映射到VCP N结构域和D1结构域之间的接口处。有研究已经发现，从IBMPFD个体提取出的细胞线粒体不能正常产生能量。Zhang等［21］通过对VCP突变的果蝇进行研究发现，其表现出IBMPFD症状（例如肌肉细胞的死亡），还发现肌肉细胞中的线粒体比正常细胞小很多，呈碎片状。而线粒体融合蛋白控制着线粒体的融合。正常情况下，VCP能降解线粒体融合蛋白，突变的VCP会使线粒体融合蛋白过度降解，导致线粒体融合程度降低，最后导致细胞功能障碍和死亡。线粒体功能障碍对IBMPFD的发病机制非常重要，但VCP突变改变线粒体功能的机制尚不清楚。

4 VCP与肿瘤的关系

Shinji等先后对156例食管鳞状细胞癌［22］、75例滤泡性甲状腺癌［23］、330例胃癌［24]、32例胰腺导管腺癌［25］和74例牙龈鳞癌［26］进行分析，结果显示，VCP在肿瘤中阳性表达明显高于正常组织，且其表达情况与转移、复发明显相关，可以判断患者的预后。刘广鹏等［27］对60例普通型骨肉瘤进行分析，发现在骨肉瘤中VCP呈高表达且与远处转移密切相关。在此基础上，龙新华等［28］利用基因沉默技术研究VCP基因在骨肉瘤细胞系U2OS的增殖和迁移情况，研究结果显示，沉默VCP基因时抑制U2OS细胞在体外增殖和迁移。随后发现miRNA-129-5p靶向调控VCP的表达而抑制骨肉瘤细胞迁徙和侵袭能力。研究发现［29］VCP促进结直肠癌的侵袭和转移，基因敲除VCP时发现细胞周期停滞在G1期并通过STAT3途径诱导细胞凋亡。Meyer等［30］对106名口腔鳞癌患者进行分析发现，HPV阴性的口腔鳞癌VCP表达明显增高并可作为HPV阴性OSCC的预后标志物。Valle等［31］对非小细胞肺癌组织和细胞系进行研究，发现VCP在非小细胞肺癌组织和细胞系呈高表达，并发现抑制VCP不但可以有效抑制肺癌细胞的迁移和增殖，而且还能诱导细胞周期阻滞在G0/G1期。Peng等［32］对663例晚期以铂为基础化疗的非小细胞肺癌患者VCP多态性与临床结果相关性进行分析，并对VCP的三种核苷酸多态性（SNPs）进行了基因分型，结果显示，SNP rs2074549与严重的嗜中性粒细胞减少症显著相关，其G/G基因型与野生型纯合子A/A相比增加了3级或4级中性粒细胞减少的风险，首次证明了VCP多态性与晚期非小细胞肺癌以铂类为基础的化疗的严重副反应有相关性。游燊等［33］发现肝细胞癌患者VCP呈高表达并与pTNM分期、静脉侵犯密切相关，对43例根治性肝癌切除的患者进行随访时发现VCP高表达者2年复发率明显高于VCP低表达者。Yu等［34］通过研究发现miR-129-5p抑制VCP的表达并通过VCP降解IκB-α参与NF-κB信号通路来调控肝癌细胞的增殖与转移。聂鸿平等［35］发现VCP的表达与胃癌的浸润、淋巴结转移相关且表达风度与肿瘤的分化程度、癌组织的浸润深度、淋巴结转移个数及病理TNM分期具有相关性，其表达是胃癌重要、独立的预后因子。Mohammed等［36］发现，VCP在CIN2/CIN3+的敏感性达到93%、特异性达到88%，未来有可能可作为宫颈癌筛查的重要生物标志物。

5 VCP的抑制剂

目前为止，共研制出几种VCP的抑制剂：（1）内质网相关降解抑制剂Eeyarestatin I，它直接联系内质网和VCP，它可以抑制VCP相关的去泛素化酶和VCP依赖性蛋白质降解，但不抑制VCP的ATP酶活性。（2）2-苯胺基-4-芳基-1、3-噻唑类化合物，它抑制VCP的ATP酶活性和VCP相关蛋白降解。（3）Syk抑制剂III通过在VCP的D2 ATP酶结构域与Cys522和泛素融合蛋白相互作用，不可逆地抑制VCP的ATP酶活性。（4）N2，n4-二苄基喹啉-2，4-二胺（DBeQ），它是通过筛选化合物库被鉴定出来的一种化学药剂，作用于VCP的D1和D2-ATP酶结构域，其特点是选择性强、高效且可逆。它可以抑制ERAD和自噬，并可以诱导细胞凋亡。（5）KUSs，其特点是作为“VCP的调节器”“ATP的监管者”不抑制细胞VCP功能的VCP。（6）CB-5083，具有口服生物可利用活性。作为第一个用于癌症治疗的VCP抑制剂正在临床试验。（7）是ML240由DBeQ衍生而来，作用于D2 ATP酶结构域。（8）NMS-873，其特点是强效、非共价、非ATP竞争及变构抑制剂，激活未折叠蛋白反应，抑制自噬并诱导细胞死亡。

综上所述，VCP在蛋白质质量控制、自噬、膜融合和细胞周期的调控等方面发挥重要作用。目前，较为肯定的是VCP促进肿瘤细胞的的转移，抑制其凋亡。因此，在未来，VCP可能预测肿瘤的转移及预后，为肿瘤的靶向治疗提供途径。