肺癌发生骨转移的机制进展

王东昌，李亚华(综述)，邵 娟，陈 刚*(审校)

(1.河北医科大学第三医院呼吸一科，河北 石家庄 050051；2.河北医科大学第三医院老年病科，河北 石家庄 050051)

发生骨转移的晚期肺癌患者承受着难以忍受的疼痛，因此需要使用世界卫生组织(World Health Organization，WHO)镇痛阶梯中最高等级的强效阿片类药物进行姑息治疗[1]。除骨转移导致的疼痛症状外，其常见的并发症包括病理性骨折、脊髓和神经压迫综合征和高钙血症，高钙血症可导致肾功能不全、心律失常，甚至导致患者死亡，严重影响这些患者的生活质量[2]。因此，预防和治疗肺癌骨转移对改善患者的生活质量和减少骨相关事件至关重要。本综述的目的是对肺癌骨转移研究领域已取得的分子机制进行概述，为探索有效预防或治疗骨转移方法提供理论基础。

1 骨髓内微环境及结构有利于骨转移发生

骨髓微环境对肺癌细胞具有特别的吸引力：骨基质含有大量转化生长因子β超家族(transforming growth factor β，TGF-β)、胰岛素样生长因子(insulin-like growth factor，IGF)、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)、血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)和钙。值得关注的是这些因子不仅储存在骨基质中，而且也可由成骨细胞主动产生[1,3]。

骨髓中的内皮细胞形成多个有孔的窦，这有利于骨髓和血液循环中细胞的内、外迁移。骨细胞和内皮细胞之间以及血管生成和骨生成之间在发育和骨再生过程具有相互调节作用，其中骨细胞产生促血管因子，而内皮细胞产生刺激骨构建的血管分泌因子[4]。具有重要意义的是，骨髓内皮细胞参与了保持癌细胞和造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)的休眠。细胞休眠是一种极其复杂的现象，它反映了骨髓微环境的复杂性和存在于其中的许多生态位。肿瘤休眠可以通过增殖停滞或使细胞死亡率与增殖率相等的方式来实现[5]。骨髓中至少有两个生态位可以使癌细胞保持静止：骨内生态位和血管生态位，二者可能在骨髓微环境中共存和协作，但都依赖于细胞与细胞的接触以及可溶性因子。许多癌细胞保持休眠的机制中与HSC用来维持自身静止的分子途径相似[5-8]，因此骨髓可能是细胞休眠发生的最常见的部位。

人体内动脉血氧分压为130～80 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，肾脏等器官的血氧分压为72 mmHg，而骨内膜中血氧分压急剧下降至50 mmHg，是一个缺氧的微环境，而这个环境条件与骨内生态位接近[1]。缺氧似乎可以直接促进骨细胞的活动[9]。研究发现氧水平适应在细胞中非常重要，无论在生理还是病理条件下其作用主要是通过缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor，HIF)家族实现的[10-11]。在非小细胞肺癌中，已有研究提出HIF-1α与骨转移之间的相关性[12]，结果显示HIF-1α不仅作为局部转移的决定因素，而且在肿瘤原发部位表达也能促进骨转移的发生。

正是由于骨髓内微环境具有以上特殊性，使得包括肺癌在内的多种恶性肿瘤易发生骨转移，其在前列腺癌中的发病率为65%～90%，乳腺癌为65%～75%，肺癌为17%～64%，结直肠癌为10%[13-14]。

2 骨组织的“良性循环”与“恶性循环”

骨组织以一种严格控制的方式不断进行着骨基质的更新，从而保证了骨沉积和骨吸收之间的微妙平衡[1]。这个过程是从一个机械或分子刺激开始，刺激骨膜或骨内膜细胞，然后这些骨内膜细胞彼此远离，暴露出需要重塑的骨表面。在此过程中同时会刺激破骨细胞前体，使其在原位分化为破骨细胞，附着并封闭暴露的骨部分，然后使其降解，进而清除降解的部分，促进成骨细胞分化。新形成的骨骼再次被骨内膜细胞覆盖，从而结束了所谓的骨骼“良性循环”。“良性循环”过程中有大量的分子参与，肺癌细胞可以在其不同的阶段对其进行改造，使其有利于促进自身的生长，当肺癌细胞将“良性循环”改造为“恶性循环”，也就标志着骨转移的发生。

在体内，成骨细胞产生有利于肿瘤生长的因子，如IGF、趋化因子、白细胞介素6和TGF-β。此外，成骨细胞还通过产生核因子κB配体受体激活剂(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand,RANKL)和巨噬细胞集落刺激因子(macrophage-colony stimulating factor，M-CSF)来促进破骨细胞的分化和活性，进一步刺激因破骨细胞骨吸收而从骨基质中释放IGF-1、BMP、PDGF、TGF-β，进而促进肿瘤生长，重新启动“恶性循环”[1,3,14]。此外，破骨细胞从骨基质中释放的钙离子除了可导致潜在的致命性高钙血症外，它们还能刺激钙敏感受体(calcium-sensing receptor，CaSr)阳性癌细胞，从而促进其生长、逃避凋亡和甲状旁腺激素相关肽(parathyroid hormone-related peptide，PTHrP)的产生能力，在“恶性循环”中发挥作用。在“溶骨性恶性循环”中，肿瘤细胞产生的多种因子(如白细胞介素6、TNF-α、白细胞介素1β)，可直接或间接刺激破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞，其结果是加剧了骨吸收过程[3,15]，造成包裹在骨基质中的上述生长因子释放，进而刺激肿瘤细胞生长。

3 肺癌发生骨转移的关键环节

为了建立“恶性循环”，癌细胞首先必须从原发部位迁移到骨骼，这一过程可简化为以下步骤：①局部侵袭；②转移到血液或淋巴系统；③在远处部位停滞并穿出血管；④免疫抵抗并在转移部位建立支持其生长的生态位；⑤肿瘤生长和转移的激活。在大多数情况下，转移过程在短时间内发生，但也可能有数年的潜伏期，随着时间的推移，即使原发肿瘤病灶较小也会脱落数百万的循环肿瘤细胞(circulating tumour cell，CTC)，这些细胞现在可被用作液体活检。CTC可能会在骨髓中转移，成为播散性肿瘤细胞(disseminated tumour cell，DTC)。转移过程中的每一步都需要一组特定的分子参与，其中一些分子可能在不同的实体癌中很常见，例如基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)[16]，而另一些分子则对不同的癌症或转移类型有特异性，如与骨骼转移相关的PTHrP[17]。

3.1肿瘤细胞归巢 归巢过程反映了癌细胞在远处器官的微环境中扎根、存活、休眠或增殖的能力。这一过程虽然非常复杂，但目前已鉴定了许多分子标志物。极迟抗原4(very late antigen 4，VLA-4)可通过与骨髓内皮细胞和基质细胞中表达的血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule 1，VCAM-1)相互作用，介导破骨细胞与骨基质的黏附，有利于癌细胞归巢和转移。尽管对HSC与癌细胞归巢机制的共性这一重要课题进行了多年研究，但它仍然具有继续深入研究的必要[18]。这其中一个关键分子似乎是基质衍生因子1(stromal-derived factor1，SDF-1)的配体C-X-C趋化因子受体4(C-X-C chemokine receptortype 4，CXCR4)。CXCR4对HSC归巢至关重要，但癌细胞也可以利用这一途径通过血流穿出血管后与骨髓基质成分相互作用[19]。

CD44和αvβ3都是骨基质的主要成分骨桥蛋白的受体[20]。CD44可能与αvβ3整合素协同作用，使肺癌细胞归巢至骨。此外，CD44可与MMP-9相互作用，使癌细胞侵袭能力提高。CD44结合CXCR4可能对推动癌细胞进入骨髓生态位很重要，而CXCR4对于保持HSC在该生态位中至关重要，而对癌细胞也很重要。AnnexinII能结合SDF-1，是帮助HSC保持生态位的另一个关键因素。而癌细胞也可以利用这种蛋白质来取代HSC在骨微环境中的位置。

关于Notch通路参与骨转移的研究还很少，直到最近几年才有关于这方面的研究[21]，Jagg-1是Notch家族成员的配体，可由转移癌细胞表达，并能与成骨细胞和骨前体结合。Dickkopf-Wnt信号通路抑制物1(Dickkopf Wnt signaling pathway inhibitor1，DKK1)是一个新的骨转移分子，已有研究表明，DKK1高表达提示肿瘤倾向于向骨转移，而DKK1低表达提示肿瘤倾向于转移到肺部，在受DKK1阻碍的通路中，这种现象仍然存在：在肺中，这种蛋白会破坏非常规的Wnt途径，这将导致免疫细胞趋化，从而减缓生长；而在骨骼中，它作用于成骨细胞，减少典型的Wnt通路激活，从而使成骨细胞-破骨细胞平衡向破骨细胞倾斜，导致骨吸收增加[22]。

CCL-2又称单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)，可以克服粒细胞单核细胞(granulocyte-monocyte，GM)-CSF的抗破骨细胞生成作用，是一种有效的破骨细胞生成诱导剂[23]。PTHrP和CCL-2之间的关系可能在骨转移过程中很重要[24]。CCL-2由PTHrP诱导，进而诱导破骨细胞生成，同时增加肿瘤血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGF-A)的生成，最终促进血管生成和肿瘤生长[23]。然而，抑制CCL-2在减少骨转移方面的作用并不确定，这也表明骨微环境是非常复杂多样的[25]。

3.2骨髓微环境中的细胞因子与骨转移 成骨细胞完成生命周期后，有三种可能结局：①发生凋亡；②成为静止的骨内膜细胞；③分化为骨细胞。当已完成生命周期的程序被激活后，成骨细胞在自身周围沉积骨基质，骨基质包裹成骨细胞后成为真正的骨细胞。骨细胞的数量远远超过其他细胞，其主要功能是通过一个复杂的相互连接的网络感知微环境中的机械变化，通过初级纤毛感知剪切应力。骨细胞能够协调并在特定情况下执行骨吸收或沉积，以感应如机械负荷或泌乳等生理环境信号，以及微观或宏观骨折等病理信号[26]。在分子水平上，骨细胞主要是通过硬骨素(sclerostin，SOST)和RANKL来实现以上作用的，SOST是典型Wnt途径的拮抗剂，可在不需要时减少骨形成，RANKL则使其控制破骨细胞的生成。

破骨细胞来源于单核细胞/巨噬细胞系的造血前体，其分化是一个多步骤的过程，涉及一系列转录因子的激活。在分化的最后阶段，破骨细胞前体表达的M-CSF与受体c-fms结合，进而促进其生存和生长。RANKL导致核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)活化，进而活化细胞浆中的钙调神经磷酸酶依赖型T细胞活化核因子(nuclear factor of activated T-cell，NFATc1)，这将使前体融合并产生成熟的、可吸收的破骨细胞。此外，过多的炎性细胞因子也可调节破骨细胞的发生[27]，而癌细胞常常利用这一特性诱导破骨细胞活动和骨吸收过程。

4 缺氧、血管生成与骨转移

缺氧在骨转移导致的疼痛中发挥一定作用，HIF-1α激活了癌细胞中的Warburg效应，从而诱导骨微环境中乳酸等成分的释放，进而向骨骼中的伤害性感受器发出信号，导致了疼痛症状[1]。另一方面是破骨细胞被“恶性循环”激活，而靶向V-ATPase可减少癌症引起的骨痛[28]，与此同时肿瘤细胞可利用V-ATPase在骨微环境中释放相关因子以利于转移发生。

与缺氧和癌症相关的另一个重要方面是持续的血管生成，缺氧增加血管生成的概念已经被认识多年。事实上，HIF-1α可以激活VEGF及其受体的表达，激活血管生成素、bFGF、PDGF、干细胞因子(stem cell factor，SCF)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、MMP、一氧化氮合酶2(nitric oxide synthase 2，NOS-2)、环氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)以及对成骨细胞骨转移有重要作用的内皮素1(endothelin-1，ET-1)的表达。骨转移瘤除了具有促进血管系统生成并输送营养和氧气外，还可以通过激活骨髓中的血管生成程序促进血管生态位的建立。VEGF一方面可以促进成骨细胞的分化和活动，助长成骨细胞的“恶性循环”，另一方面，它可以激活破骨细胞的生成，助长“溶骨恶性循环”。BFGF同样可以触发破骨细胞分化，也可以激活成骨细胞活性，因此，可能导致骨转移的两个“恶性循环”。

5 免疫细胞在骨生物学和肿瘤转移中的作用

免疫细胞是骨生理学和病理学中最重要的调节因素之一。Th17细胞可直接或间接通过成骨细胞诱导RANKL和M-CSF，诱导破骨细胞生成，而免疫抑制性T-reg细胞则抑制破骨细胞生成。B细胞可产生RANKL，RANKL既是自分泌因子，又是破骨细胞生成的诱导因子。此外，中性粒细胞主要通过细胞因子分泌和原位吸引Th17淋巴细胞来影响骨生理。所有这些存在于骨髓中的免疫细胞除了影响骨生物学之外，还影响骨转移过程。

骨转移患者血液循环中的破骨细胞前体数量增加，而这些细胞与T细胞共培养时无需RANKL或M-CSF，即可导致破骨细胞生成。T细胞和肿瘤细胞之间的RANKL-RANK接触可促进肿瘤生长、侵袭和转移。通过敲除Lyn酪氨酸激酶可增加T细胞的反应能力，导致破骨细胞骨吸收增加，而抑制骨转移生长。

转移性骨生长的另一种重要细胞类型是髓源性抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)。MDSC的特征是Gr-1和CD11b共同表达，可抑制先天性免疫和获得性免疫，从而促进包括肺癌、乳腺癌和多发性骨髓瘤在内的多种癌症的肿瘤生长。MDSC还能够通过分泌VEGF和bFGF来激活肿瘤血管生成，这些VEGF和bFGF可激活成骨细胞和破骨细胞的活性，从而促进成骨细胞和溶骨的恶性循环。免疫细胞也参与了两种不同类型肿瘤休眠的建立。一方面，潜在的休眠肿瘤细胞与HSC竞争其休眠的骨内生态位[29]，另一方面，免疫细胞也能够抑制转移癌细胞或原发癌细胞，平衡肿瘤增殖能力和免疫介导的对肿瘤的杀伤能力，从而诱导肿瘤进入休眠状态，这个过程被称为免疫介导的休眠[30]。此外，已证明中性粒细胞和巨噬细胞被癌细胞交替激活为M2或N2表型，从而成为肿瘤相关中性粒细胞(tumour-associated neutrophil，TAN)或巨噬细胞(macrophages，TAM)，最终导致血管生成增加和包括骨转移在内的肿瘤播散。以上内容并不是骨微环境中癌细胞和免疫细胞之间的全面相互调节，因为如果一个肿瘤能够在机体强大的免疫监视及清除系统中生长，它对免疫系统的作用一定是相当复杂的。

6 细胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)与骨转移

EV是直径为20～1 000 nm的颗粒，其含有多分子物质，可以反映原始细胞的组成，或者富含特定分子，与多种病理生理事件有关，几乎每种细胞类型都可以将其用作旁分泌和远距离信息传递的手段[31-32]。癌细胞可以利用EV来影响它们的微环境，促进肿瘤的进展、转移和器官向性[33]。研究发现成骨细胞通过成骨细胞-EV-RANKL的方式可无需直接接触细胞就能促进破骨细胞存活[34]。

EV可以根据膜上的整合素集在肿瘤转移时判断肿瘤的器官取向性，重新改造一个特定的微环境，使之成为一个预转移生态位，但是目前未发现特定的EV整合素与骨转移发生有直接关系。另有研究表明肺癌源性EV介导的双调蛋白(Amphiregulin)[35]或miR-21[36]可促进破骨细胞的生成，而另一研究中发现了在转移性肺癌中富集的EV-miR信号。

EV是细胞的通讯载体，在药物传递领域开辟了许多可能性，如能在EV装载药物，可以使不良反应最小化，同时增加靶细胞内的药物浓度。因为骨内生态位是缺氧的，灌注也相对较小，以EV为载体的靶向治疗将有助于提高细胞毒性药物的疗效。

7 展 望

近年来在肺癌骨转移方面已经开展了大量工作，确定了一些有效的治疗方案，如双膦酸盐和特异性靶向RANKL的地诺单抗，它们都是针对恶性循环的破骨细胞。因此，骨转移是可以治疗的，但目前仍然无法治愈。对肺癌发生骨转移的分子生物学机制的认识还很局限，很多问题还需研究人员继续深入探索，有理由相信随着对其机制的认识不断地深入，必将为新的治疗和预防方案提供更多的理论依据，以期克服这种常见的肺癌并发症。