玉米孤雌生殖诱导育种法的研究进展

韩雅利，史丽丽，王 磊，史明山，范子洋，焦宏业

（邯郸市农业科学研究院，河北邯郸056001）

我国当前玉米育种的方法有很多，如二环系自交选育、回交改良选育、群体构建选育、轮回选择选育等，这些方法获得自交系都需要很长的时间，而采用孤雌生殖诱导的方法选育自交系可使材料的纯合从常规育种的5～7 a缩短到1～2 a，大幅度缩短育种时间[1]，加快育种速度，提高育种效率。玉米孤雌生殖诱导方法包括2种形式，一种是利用孤雌生殖诱导进行杂交获得单倍体，然后对单倍体进行加倍获得纯系，即一般所说的单倍体育种[2]；另一种是利用化学药剂处理基础材料花丝，直接诱导出二倍体籽粒[3]。

我国玉米育种竞争激烈，基层育种单位多以杂交选育等常规方法进行自交系创新。由于缺乏成熟的操作参数，阻碍了孤雌生殖诱导法在育种中的广泛应用[4]。笔者通过对玉米孤雌生殖诱导法的2种方式进行论述和比较以及具体操作参数进行分析，旨在为玉米育种工作提供参考，推进玉米育种工作的进程。

1 玉米生产及种质创新的重要性

玉米是当前最大的粮食、饲料作物，还是生物燃料、食品、医药、化工等众多行业的原料作物。玉米基本自给是我国粮食安全的底线，因此，玉米生产稳定是国民经济发展的重要组成部分，也是粮食安全的首要方面。

选育新品种是推进玉米产量和品质进一步提高的最可行、最快捷的途径。21世纪以来，黄淮海地区主推品种先后有掖单系列、冀丰58、农大108、郑单958、先玉335等，正是代表品种的出现使玉米的产量、品质以及管理方式出现质的提高。每一次品种更新换代都伴随着优良自交系的创新，同时优良自交系的出现也将推动新一轮次的品种诞生，育成突出骨干系是研究者对育种工作的重要贡献。

2 玉米的育种方法及途径

当前玉米育种主要是把自交系、地方品种、杂交种等通过杂交等手段达到创造新的基因组合，从而获得新种质的过程，该过程最终要通过多代自交的方法获得自交系，至少经过6个世代[5]。除此之外，还有孤雌诱导育种、诱变育种、分子标记辅助选择等育种选系方法。孤雌生殖诱导进行玉米单倍体育种的方法，可以在2个世代内得到纯系,提高育种效率、缩短育种年限。

2.1 利用单倍体诱导系的育种方法

单倍体技术是指通过自然发生或人工诱导获得单倍体，然后经过自然或人工染色体加倍恢复其倍性，并在此基础上进行选择从而获得所需纯系的方法。1950年美国一家种子公司发现了一份能够高频率诱导单倍体的玉米自交系材料，并命名为Stock6，推进了单倍体的育种工作[6-7]。与传统育种方法相比，单倍体育种技术在自交系选育上具有快速、准确、高效的特点，因而越来越受到育种家的重视[8]。我国研究者刘志增等[9]、陈绍江等[10]利用Stock6同高油群体材料杂交育成了一些高诱导率、鉴别方法简单的诱导系，以陈绍江育成的CAU5最具代表性，并通过国家产业体系平台在国内较大范围发放和传播。目前，获得玉米单倍体的主要途径有组织培养、药剂处理、远缘杂交诱导、孤雌生殖诱导等方法。

2.2 利用化学药剂诱导孤雌生殖直接形成二倍体籽粒

化学药剂诱导孤雌生殖是指利用炔苯酰草胺、二甲基亚砜、赤霉素、马来酰肼、萘乙酸、聚乙二醇、秋水仙素等化学药剂，在基础材料抽丝时对花丝进行注射处理，在不受精的情况下，直接获得加倍的籽粒，从而获得纯系[11]。常用方法是花丝尚未抽出时将雌穗套袋，待花丝完全抽出5 d后剪去顶端，利用经严格花粉灭活的剪刀将雌穗顶端苞叶和花丝剪平，并在顶端平面拨出一个凹形坑，再用注射器将化学试剂注射到凹形坑，每个雌穗用药2 mL，最后套上纸袋[12]。

3 孤雌诱导育种方法的优缺点

3.1 孤雌诱导育种方法的优点

整体上来说，孤雌诱导育种育成自交系的时间短[13]。单倍体诱导系诱导再加倍，需要2个世代；化学药剂直接诱导二倍体只需要1个世代，极大地提高了育种效率，加快了自交系创新进程和品种更新速度。

孤雌诱导育种育成的自交系纯度高。孤雌诱导获得二倍体自交系只要保证获得的是正常的二倍体，就能保证100%的纯度[14-15]。在纯合上的准确率比杂交育种更为精准，杂交育种即使自交6代以上也不能保证育成的自交系是完全纯合的。因此，孤雌生殖诱导也可以用于某一优良材料的提纯，提升种质质量，解决品种在生产中表现差异的棘手问题。

3.2 孤雌生殖诱导育种方法的不足

育种程序繁琐。除常规的套袋等工作要求更加严格外，又增加了配制药剂、药剂处理、种子挑选等很多环节。工作内容和程序比常规育种增加了很多，对育种研究者有一定的不适应性[16]。

获得的种子比例少，这是限制该技术应用的一个主要方面[17]。常规育种在选育过程中会有不断增加的种子量，而孤雌生殖诱导获得的材料会不断减少，由于每一阶段都仅有小比例的材料进入下一阶段，以致最后获得有价值的种子数量非常少。

所需药剂具有一定的毒性。2种形式的孤雌生殖诱导方法都需要用到各种化学药品[18]。例如，秋水仙素、炔苯酰草胺、马来酰肼等，尤其秋水仙素具有较大毒性，在药品配制、药品处理过程中都需要采取严格的保护措施。

4 玉米孤雌生殖诱导技术研究

玉米孤雌生殖诱导技术尤其是化学诱导二倍体形式，在具体技术层面还不太成熟，由于各个研究在药剂种类及浓度上都不尽相同，最佳的结果也不同，没有形成大家公知的孤雌生殖诱导育种方法标准，研究结果存在一定的差异[19-20]。

4.1 单倍体自然加倍率极低

玉米单倍体的自然加倍是指在田间自然生长条件下，当雄穗散粉时授粉自交，有花粉但花药不开裂时人工破坏花药，散出花粉授粉自交[21]。自然加倍主要发生在单倍体的诱导过程中，而在单倍体生长阶段的自然加倍概率很小，效率极低，一般为0.05%～1.00%[22]。为了满足育种的需要，运用人工加倍的方法显得尤为重要。

4.2 孤雌生殖诱导系诱导相关技术研究

4.2.1 单倍体诱导系产生率高 单倍体的诱导从1964年曼陀罗花药培养获得单倍体[23]开始迅速发展，虽受基因型、培养条件[24]等一系列因素的影响，导致单倍体诱导难度较大，但单倍体诱导系产生率可达到12%左右，远远高于单倍体自然发生率。

4.2.2 影响单倍体加倍的因素 此项技术需对各种加倍方法、影响因素、加倍机理及基因型差异开展广泛的研究，并在此基础上研究出高效的诱导途径[25]。诱导率普遍较低的主要原因是加倍难度较大：一是影响加倍成功的因素，包括加倍方法、处理浓度、时间、温度的选择[26]，只有当所有因素同时合适才能加倍成功。如在甘肃等地春播，自然加倍率较高，有可能低温条件下生长缓慢，有助于单倍体加倍概率增加；在海南冬季种植时花粉量则较大，结实性好，诱导率高，一般可达11%左右。二是不同基因型间对加倍试剂的适应是不同的[27]，不同种间的加倍体系不具有重复性。三是加倍试剂都有不同程度的毒害作用，常使材料在处理过程中死亡。四是加倍过程中经常出现嵌合体现象，即同一植株中，只有部分分生细胞的染色体数加倍。

4.2.3 单倍体加倍药剂的配制 常用的化学药物有硫酸二乙酯、2，4-D、马来酰肼（MH）、萘乙酸（NAA）、6-苄氨基嘌呤（6-BA）、赤霉素（GA3）、秋水仙素（COL）和二甲基亚砜（DMSO）等。其中，秋水仙素效果最好，使用最广泛，是主要的加倍试剂，但秋水仙素毒性大[28]，所以，研究者用毒性低的其他化学药剂如氟乐灵、甲基胺草磷、炔苯酰草胺等诱导，辅助试剂一般用2%二甲基亚砜[29-30]，也有较好的加倍率。

4.2.4 加倍处理方式及效果 加倍处理方式有浸种法、浸根法、浸芽法、滴心叶法、注射法等，处理效果各个研究者结果不一[31-33]。浸种、浸芽法均比较繁琐，工作量大，需要育苗移栽，且需要较长时间接触有毒的化学药剂，大规模开展需要耗费太多人力物力。

浸种法：该方法是最简单的加倍方法，即用秋水仙素溶液浸泡萌动的单倍体种子。先将单倍体种子用清水浸泡20～24 h，种子吸胀后，用秋水仙素溶液浸泡8～12 h，再用清水浸泡1～2 h后再播种[34]，以减少对种子的伤害。采用0.06%秋水仙素浸泡胚芽切口的单倍体种子，浸泡处理12 h单倍体加倍率最高，为17.01%[35]。

浸根法：该方法主要是用秋水仙素溶液浸泡单倍体幼苗根。将2～3叶期单倍体幼苗的根系在0.05%的秋水仙素溶液中浸泡24 h，清水冲洗处理后，移栽于生长发育条件良好的环境下[36]。BORDES等[37]用该方法处理3叶期幼苗的根尖3 h，散粉率达到了30%～60%。该方法加倍效果较好，但需要的药剂量大，成本较高。

浸芽法：当单倍体籽粒发芽到2 cm左右时，用刀片削掉幼芽顶端的胚芽鞘，在黑暗温度18℃下浸泡12 h，然后用清水清洗后播种。ZABIROVA等[38]在18℃、黑暗条件下用0.06%秋水仙素溶液处理胚芽鞘12 h，18℃、26℃恢复2 d，加倍率分别为28.8%和31.5%。EDER等[39]利用该方法处理单倍体，49.4%的单倍体产生了可育花粉，其中，39.0%的单倍体能够自交，27.3%的单倍体自交后结实。

滴心叶法：在单倍体3～5叶时，用0.5 mg秋水仙素滴至玉米心叶处[35]，该方法简便易行，加倍效率为散粉率28.9%，结实率11.1%。

注射法：有2种处理方法：第1种为在田间用秋水仙素溶液注射6叶期单倍体的盾片节；第2种为在室内用秋水仙素溶液注射3～4叶期单倍体幼苗的生长点。CHASE[40]用0.05%秋水仙素和10%甘油的水溶液0.5 mL注射6叶期玉米幼苗的盾片节，结实率较对照提高了3倍以上。DEIMLING等[41]用0.125%秋水仙素溶液注射3～4叶期幼苗茎尖生长点，然后在18℃、黑暗条件下保持2 d，加倍率为27.5%。

4.3 化学药剂诱导孤雌生殖相关技术研究

4.3.1 处理药剂及浓度 用做孤雌诱导的化学药剂[42]主要有炔苯酰草胺、秋水仙素、氟乐灵等，浓度一般为40～90 μmol/L，二甲基亚砜浓度为2%。

4.3.2 处理时期 多数认为，化学药剂诱导在抽丝后3～5 d处理花丝效果最佳，也有试验称在抽丝前处理效果最佳[43]。

4.3.3 处理方式 主要有喷洒法和注射法。喷洒法是在适宜时期，用经花粉严格灭活的剪刀将雌穗顶端苞叶剪平，并在顶端拨出凹坑，将2 mL药液洒入；注射法则是在适宜时期用注射器将2 mL药液注入雌穗和苞叶的缝隙中。

4.3.4 处理效果 早期研究的相关结果差异非常大。赵佐宇等[3]用2%DMSO和40 mg/L MH药剂组合进行花丝处理，诱导率为0.47%；而余建华等[44]用2% DMSO、50 mg/L MH和5 000 mg/L PEG的药剂组合处理抽丝后5 d的花丝，诱导率为0.526%。赵念力等[45]以秋水仙素、马来酰肼等组合药剂处理果穗，籽粒诱导率最高为0.176%。任燕静等[46]以氟乐灵和炔苯酰草胺处理花丝，结实株率分别达到24.03%和36.36%。

5 展望

我国玉米育种竞争激烈，基层育种单位多以杂交选育等常规方法进行自交系创新。由于玉米孤雌生殖诱导育种方法缺乏成熟的操作参数，操作复杂性、周期长、受环境影响较大等特性，目前2种形式的处理方法都没有成熟的操作规程见报道，缺乏对2种方法的系统比较，阻碍了孤雌诱导在育种上的推广和应用[47-50]。

现阶段，研究者在不同单一药剂、药剂组合、药剂浓度、处理时期、处理方法上进行试验，在单倍体诱导系育种和化学药剂直接诱导二倍体育种的方法上都取得了成功的经验和数据。2种方法中，第1种利用单倍体诱导法在现实研究中居多，使育种周期缩短到2代，第2种利用化学药剂直接诱导二倍体纯系时间更短，一般1代就可以得到纯合的二倍体种子，极大地加速了育种进程，加快优良品种的选育进度[51-55]。

这都表明孤雌生殖诱导育种在实践中是可以获得纯合二倍体自交系的，这对遗传分析具有极大的意义[56-57]。今后研究者可以更加全面系统地对孤雌生殖诱导育种进行研究，形成详尽的操作标准，为整个育种行业做出突破。