王红坤,王艺桦,周丹银,张 炫
(云南农业大学动物科学技术学院蜂学系,云南 昆明 650201)
饲养蜜蜂对农作物的增产作用是维护全球粮食安全的重要保障,并有不可替代的生态和社会价值。蜜蜂蜂群受到来自细菌、真菌、病毒、寄生虫等多种病原的危害,全球化的蜜蜂蜂群和蜂产品贸易,加速区域性蜜蜂病虫害的扩散,给现代养蜂生产带来新的挑战[1]。第一个蜜蜂病毒- 蜜蜂囊状幼虫病毒(Sac brood virus) 于1913 年被首次报道,随后百年间有近30 余种蜜蜂病毒被报道,但并未引起足够的重视[2]。直至2006 年蜜蜂蜂群崩溃综合征(Colony Collapse Disorder,以下简称CCD) 在北美及欧洲大范围暴发后,蜜蜂病毒病才引发广泛关注[3]。历史数据显示20 世纪50 年代以来,欧洲和北美饲养蜂群数量的持续下降与蜜蜂病毒危害相关[4]。蜜蜂病毒多为RNA 病毒,有种类多、易变异、多因素联合致病,多寄主寄生的特性,可在同生境条件下进行相互交叉传播,导致在致病机理研究和疾病防控上依然知之甚少,也一直是蜜蜂病害研究的热点[5]。
DWV 诱发的蜜蜂残翅病具典型发病特征和极强致病性,常被作为一种代表性的蜜蜂病毒病研究模型受到科学家的重视。本文以蜜蜂DWV 为代表,从蜜蜂残翅病的病原学、流行病学、临床症状及防控方面多个角度的论述蜜蜂病毒病的发展历史、危害和研究方向。
DWV 属小核糖核酸病毒目(Picornavirales)、传染性软化病毒科(Iflaviridae)、传染性软腐病病毒属(Iflavirus)[6]。DWV 为10 Kb 大小的单顺反子RNA 病毒,因缺少校对机制极易变异,伴随不断扩大的寄主范围, 不断演化出新的变异体: DWV-A、DWV-B 和DWV-C[7]。 DWV最初基因(DWV-A), 包括先前大部分DWV 序列和Kakugo 病毒(KV)。DWV 病毒直径约为30 nm,由无被膜的二十面体蛋白衣壳和衣壳内的一个正义单链RNA 组成。基因组5’端较长的非翻译区域(5’UTR) 和3’端较短的高度保守的非翻译区域(3’UTR) 对基因组翻译和复制调节非常重要[8]。通过低温电子显微镜确定DWV 病毒粒子的结构为3.5 的分辨率,通过X 射线晶体学确定为3.8 的分辨率[9]。DWV病毒粒子由排列在二十面体不对称衣壳中的VP1、VP2 和VP3 亚基构成,主要的衣壳蛋白具有β- 折叠结构,并根据β- 折叠惯例命名为B 至I β- 折叠(如图1)。DWV 壳层的低温电镜和X 射线结构相似。
图1 DWV 的二十面体不对称单位及其病毒粒子在交替构象中的结构
多聚蛋白的氨基末端从前导肽(Lp) 开始,接下来分别是结构衣壳蛋白VP2、假设的VP4 和VP1 和VP3;其羧基端含有非结构蛋白、RNA 解旋酶的保守基序、假设基因组连接蛋白(VPg)、3C- 蛋白酶和依赖于RNA 的RNA 聚合酶[10]。Lp 具有蛋白酶活性,在氨基酸水平高度可变。相关研究发现DWV 与其变异体VDV-1 差异最大的位置是Lp,同源性只有73.9%;而解旋酶似乎是基因组中保守度最高的区域,同源性至少为87.9%;第二保守区是3'UTR (87.2%), 这表明该非编码区在DWV 病毒中起重要作用[11]。
结构蛋白VP1、VP2 和VP3 的亚基排列成原聚体,每5 个原聚体在衣壳蛋白上形成一个单位,其封闭和开放控制着病毒的释放过程[12]。Picornavirales 的多数病毒基因组编码的小蛋白VP4 参与细胞膜通透性的改变过程,能够影响膜的渗透性。 如吸血猎椿病毒(Triatoma Virus,TrV)的小蛋白VP4 插入膜中形成新的蛋白通道,膜的渗透性随pH 值升高而升高[13]。
DWV VP3 亚基包含C 端延伸,形成一个病毒粒子表面P 域定位,其位置取决于周围溶液的组成。DWV VP3 亚基的P 结构域为球形,直径为30,具有高流动性。而DWV 结构中的残基可能提供病毒进入宿主细胞所需的酯酶、脂肪酶或蛋白酶活性或参与受体结合[9]。
自1977 年从无发病症状的埃及成年蜜蜂病毒(Egypt bee virus,EBV) 体内得到DWV。1982 年通过血清学试验从日本畸形的成蜂内得到一株与EBV 亲缘关系较远的病毒,因分离病毒的成蜂翅膀畸形明显,称之为蜜蜂残翅病病毒。
DWV 寄主分布广泛。多个熊蜂种(BombusSpp.)、胡蜂(VespidaeSpp.)和6 个蜜蜂种及多种蜂巢寄生虫中均能检测到DWV[14];DWV 在开花植物中,蜜蜂、花粉负载和其他非蜜蜂膜翅目传粉者中存在;且蜂房内储存的花粉和蜂蜜中的病毒可以保持感染能力6 个月[15]。DWV的宿主涵盖了10 个目的68 种节肢动物,其中64 种节肢动物属于昆虫纲Insecta[16],包括膜翅目Hymenoptera、 半翅目Hemiptera、 鞘翅目Coleoptera、 双翅目 Diptera、鳞翅目Lepidotera、 革翅目Dermaptera 和蜚蠊目Blattodea 7 个目。4 种节肢动物属于蛛形纲Arachnida,包括蜱螨目Arachnoidea、蜘蛛目Araneae 和盲蛛目Opiliones 3 个目。
DWV 是中国主要的非本土欧洲蜜蜂病。从中国锦州和秦皇岛分离出的DWV-A 型毒株China1-2017 和China2-2018, 与 日 本 的KV-2001 毒株密切相关。分别显示出96.7%的核苷酸同一性和98.1%的氨基酸同一性[17]。从锦州地区患病蜜蜂中扩增出编码蜜蜂残翅病毒Helicase 蛋白酶的基因片段DWV-JZ,与Gen-Bank 中的DWV-JL1 同源性达到95%[18]。
DWV-A 在西方蜜蜂中的流行率高于东方蜜蜂。DWV-B 在西方蜜蜂中罕见,在东方蜜蜂中没有出现[19]。DWV-B 变体在英国和威尔士的蜂群中普遍存在并占主导地位, 而DWV-A 在美国普遍存在并且占主导地位。其中DWV-B 还是英国长期存活的耐瓦螨蜜蜂种群中的主要变异体,表明该变异体通过重复感染排除了更多致命的DWV-A[20]。
2.2.1 水平传播
DWV 存在于蜜蜂大脑、中肠上皮、脂肪体以及成年蜜蜂的粪便、饲喂蜂的腺体分泌物中。蜜蜂通过取食、喂食、护理幼虫或清理巢房、访问花朵及梳理毛发[21]进行水平传播。有症状个体中,病毒普遍存在于各个部位,尤其在消化道上皮细胞中聚集,大量病毒颗粒脱落进入内腔[22]。另外,狄斯瓦螨—病毒联合危害西方蜜蜂饲养蜂群。在泰国的蜂箱中,DWV感染率也高于其他蜜蜂病毒,蛹中流行率高于成年蜜蜂。表明存在除狄斯瓦螨以外的其他传播途径的可能性[23]。而小蜂螨(Tropilaelaps mercedesae) 的不断扩散,也将造成DWV 传播从而对蜂群产生威胁[24]。
2.2.2 垂直传播
垂直传播是由亲代传播到子代的一种传播方式。DWV 存在于健康蜜蜂的精液和受感染蜂王的受精囊、卵巢和卵中[22],可能说明DWV具有增强其垂直传播的适应性倾向。通过人工授精方式直接证明了DWV 通过雄蜂和蜂王垂直传播的路径[25]。有研究证明跨卵传播是垂直传播的主要形式,但不能排除低水平的卵巢传播[26]。而蜂王交配后的DWV 载量明显提高,并且主要存在于腹部和胸腔,而头部、卵巢、精囊和精子的病毒载量较低,暗示DWV 存在垂直传播,但主要依赖水平传播[27]。
寄主在感染DWV 后,体内转录反应会发生变化,如通过免疫系统基因的表达或抑制,进而适应DWV 不同的传播方式。对相关基因的定量检测,更有利于探索DWV 传播途径对宿主的影响[28]。
DWV 是少数几种会导致寄主表现典型发病症状的蜜蜂病毒,发病成蜂羽化出房时翅残缺、畸形、褶皱,腹部萎缩和褪色[29],幼蜂喙突出,出房时间延长,死亡率增加,下咽腺和下颌腺发育不全[30],失去飞行能力,只能爬行,1~2 日后死亡。DWV 可以侵染所有蜜蜂种群和性别(蜂王、工蜂和雄蜂)以及所有发育阶段(精子、卵、幼虫、蛹、成蜂)的个体。
DWV 还损伤蜜蜂神经元,促使工蜂过早从内勤蜂转变为采集蜂[31]。有症状的蜜蜂触角中含有大量的DWV,病毒衣壳在蜜蜂触角上皮区域聚集呈晶体状,且感染区域完整性也受到破坏,表明触角的功能受损,影响蜜蜂的交流[32]。DWV 对卵、蛹表现出低毒性,其死亡率较低。但缺乏关于蜜蜂免疫防疫系统的相关研究。
已证实DWV 是引发蜂群崩溃失调症(CCD)和越冬群体损失(OCL)的主要病原体,且3 种变异体均有影响,但DWV-C 在流行性和病毒载量方面相对较弱[33]。美国饲养蜂群2010年至2016 年DWV-B 阳性检出率由3%升至66%[34]。
病毒病的危害程度是寄主与病原体在分子和细胞水平相互作用结果的表现形式[35]。无症状DWV 感染在蜂群受到压力或遇到一定的环境条件时,可引起明显的疾病症状。其中,瓦螨和DWV 组合会引起蜜蜂的免疫抑制和增加其他致病菌的易感性,被认为是蜂群崩溃症的显著因子。
相较许多高毒力的病毒(如CBPV、ABPV、BQCV、SBV 和SPV),DWV 的弱毒性让宿主的卵、幼虫及蛹期不被杀死而使瓦螨能够寄生存活,并将病毒传播给新宿主,使其成为与瓦螨密切相关的主要病毒[36]。
病毒有长期共生和应急性侵染2 种生存策略,可通过调节其在宿主体内的病毒颗粒数量达到长期潜伏或急性致死目的。健康蜂和残翅蜂之间不同的病毒浓度表明病毒滴度是成年工蜂中出现残翅现象的一个关键因素。但病毒在寄主个体或种群内的复制动态也依赖于寄主的健康状况及外界生物或非生物因素的影响。研究证明DWV 侵染瓦螨后,能在瓦螨体内进行复制增殖,再将高浓度残翅病毒变异毒株注射到寄生蜂蛹体内[37]。但通过蛋白组学发现狄斯瓦螨体内并没有进行DWV 的复制,病毒颗粒通过淋巴补血的方式积聚在狄斯瓦螨肠道中。而狄斯瓦螨的唾液毒性蛋白(Varroa toxic protein,VTP)重组表达时能增加DWV 滴度,促进封盖幼虫发育为残翅蜂[38]。
迄今为止,DWV 的具体致病过程仍未得到明确揭示,通过构建重组DWV 基因组并在起始位置加上绿色荧光蛋白(eGFP) 标记,可以在荧光显微镜下观察DWV 的去向以及复制增殖[39]。为进一步研究DWV 治病过程提供了方向。
由于缺乏在病毒传播动力学、发病机制、流行病学和寄主免疫学方面的知识及相关数据,蜜蜂病毒病的流行与传播机制仍未得到完全揭示,主要根据临床症状来诊断和防治蜜蜂残翅病[40]。目前尚无有效预防和治疗手段;加上蜜蜂的新引进和国际交流,蜜蜂病毒在全球范围内迅速传播[41]。DWV 防控可从以下2 个方面着手:一是提高蜂群群体免疫力;二是利用RNAi 技术抑制DWV 的增殖。
为了提高蜂群群体免疫力,生产实践中应加强防控,注重卫生,采取合并弱群、维持强群,及时补充花粉[42]的管理措施,维持蜂群对病虫害的较强抗性。另一方面,通过人工育种培育筛选具备抗DWV 特性的蜂种,包括具备在不同季节以及不同类型的蜂箱中均表现出高效卫生能力的蜂种[43],以及适当引进抗螨蜂种。抑制DWV 的增殖主要基于RNAi 介导和基因编辑敲除VTP 受体基因的有效抗螨方法,保护蜂群健康[44]。
随着对DWV 的深入研究,未来有望利用RNA 基因组中的碱基与DWV 衣壳在五重轴附近相互作用的结构开发抗病毒化合物[5]。另有一种假说:瓦螨和DWV 病毒诱导蜂群发生化学反应,释放化学信号,引起蜜蜂的卫生反应[45],为DWV 防治提供了一种新的思路。但DWV 的防治应是多种方式的结合,从而达到更加高效、安全的目的,未来的养蜂业也将向环境友好型不断迈进[46]。