CAR-T疗法在消化系统肿瘤中的研究进展*

彭宇，姚定康

200003 上海，海军军医大学附属长征医院 消化内科

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)免疫疗法是一种改良的T细胞免疫治疗术，是将抗体对抗原的高特异性与T细胞对靶肿瘤的细胞毒性相结合的一种方法。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)的基本结构为胞外抗原识别结构域、跨膜结构域和胞内信号结构域[1]，胞外抗原识别结构域是识别肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原的单链可变区(single-chain variable fragment，scFv)，scFv通过铰链区、跨膜区与胞内信号转导通路相连，当T细胞识别肿瘤抗原后，scFv段与肿瘤抗原结合可直接激活并启动T细胞杀伤机制。这种CAR结构使T细胞越过主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)提呈机制直接识别肿瘤细胞，避免了由于MHC分子的限制和MHC分子表达下调引起的肿瘤免疫逃逸问题[2]；且MHC只能提呈蛋白质片段，而CAR得益于其抗原抗体机制还可识别细胞表面的多糖以及脂类蛋白；CAR-T细胞回输到体内识别肿瘤并激活后可稳定增殖以形成持续杀伤力，并通过释放细胞因子等方式召集其他免疫细胞协同作战。这些性质使得CAR-T疗法与单抗以及小分子靶向药物等血药浓度会随时间下降的治疗方式相比，具有明显的优势。本文将对CAR-T的发展以及在消化系统肿瘤中的进展做一个较为详尽的介绍，旨在为CAR-T未来的发展方向及在消化系统肿瘤的临床应用提供参考。

1 CAR-T疗法的发展

CAR-T疗法目前已发展至第四代，第一代CAR仅有scFv和一个CD3ζ胞内信号域，由于缺少必要的共刺激信号，在体内扩增能力有限;第二代增加了一个共刺激信号CD28或4-1BB;第三代则包含两个共刺激信号，一个是CD28或4-1BB，另一个为OX40、DAP-10或ICOS，使得 CAR-T 细胞在体内持久稳定扩增并且分泌细胞因子增加从而有效杀伤癌细胞;第四代CAR-T细胞又被称为TRUCK T细胞(T-cells redirected for universal cytokine killing )，新加入的细胞因子序列使CAR-T细胞在肿瘤区域分泌特定的细胞因子，增强了抗肿瘤免疫反应，开启了CAR-T疗法应用于实体肿瘤的新思路。

2 CAR-T疗法在消化系统肿瘤中的研究

2.1 肝癌

迄今为止，CAR-T疗法在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)治疗的临床前研究成果颇丰，磷脂酰肌醇聚糖3(glypican-3,GPC3)是研究的热门靶点，α甲胎蛋白、粘蛋白1(mucin 1,MUC1)、上皮细胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecules,EpCAM)和癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)等亦是HCC患者CAR-T治疗的良好靶标[3]。GPC3在HCC中高表达但在正常组织中表达受限，靶向GPC3的CAR-T细胞可有效消灭GPC3阳性的HCC细胞，为GPC3阳性的HCC提供了治疗策略，目前已有靶向GPC3的CAR-T细胞用于治疗HCC的十几个临床试验[4- 5]。含有hYP7受体的CAR-T细胞对GPC3的C端具有高亲和力，CAR(hYP7)T细胞可能通过诱导穿孔素和颗粒酶介导的癌细胞凋亡，或下调Wnt信号转导以清除GPC3+HCC细胞，研究结果显示被注射CAR(hYP7)T细胞的小鼠中，有66%的小鼠体内的HCC被消灭[6]。为减少单靶点CAR-T伴随的脱靶效应，Chen等[7]开发了靶向GPC3和唾液酸糖蛋白受体1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)的CAR-T，这种双重CAR-T可杀死同时表达GPC3和ASGR1抗原的HCC细胞，但不影响单独表达两种抗原的正常组织细胞，特异性、安全性和抗肿瘤作用更强。

程序性死亡受体1(programmed cell death 1,PD-1)及程序性死亡受体-配体1 (programmed cell death-ligand 1,PD-L1)介导的T细胞抑制与包括HCC在内的多种实体瘤的免疫逃逸有关，抑制GPC3 CAR-T的PD-1表达可以增强CAR-T对HCC细胞的杀伤作用[8]。与对照组GPC3 CAR-T细胞相比，阻断了PD-1 / PD-L1通路的GPC3 CAR-T细胞特异性识别并裂解GPC3+HCC细胞的能力更强，且治疗后的HCC异种移植小鼠血液循环和肿瘤组织中CD3+T细胞水平更高，而颗粒酶B和Ki67表达水平更低[9]。因此，构建一种同时阻断肿瘤免疫逃逸通路的新型GPC3 CAR-T细胞可能是治疗HCC的新型策略。

CAR-T细胞能够在肿瘤区域分泌特定的细胞因子，目前主要是白介素12(interleukin 12,IL-12)，在肝癌小鼠模型中诱导表达IL-12可以增强GPC3 CAR-T功能，并减少细胞因子过量释放的副作用[10]。另外，用CAR-T联合化疗亦可有效降低治疗副作用，低剂量的索拉非尼即可增强CAR-T细胞在肝癌小鼠体内的抗肿瘤作用，促进肿瘤相关巨噬细胞介导的IL-12分泌和癌细胞凋亡，表明索拉非尼与GPC3 CAR-T联合治疗HCC具有临床应用潜力[11]。异曲同工的是，Zhang等[12]开发了一种靶向CD147的新型诱导型CAR-T，通过在HCC局部注射强力霉素，可增加CAR-T细胞在肿瘤组织中的驻留率并可减少全身吸收，且强力霉素的存在促进了CD147 CAR-T细胞增殖和细胞因子分泌，这或许是一种可行的CAR-T联合治疗策略。但CD147是肿瘤相关抗原，因此CD147 CAR-T细胞仍然可能识别并攻击表达CD147的正常组织，这也是其不足之处。

2.2 胰腺癌

胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺最常见的恶性肿瘤，间皮素(mesothelin,MSLN)、CEA、HER2、MUC-1、NK-R、前列腺特异性抗原(prostate-specific antigen,PSCA)、CD133和CD24是CAR-T治疗PDAC的常见靶标[13]。MSLN是一种细胞表面糖蛋白，其过表达会促进细胞增殖和迁移，MSLN高表达的癌细胞中抗凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1上调，从而抑制TNF-α诱导的细胞凋亡[14]。与对照组CAR-T细胞相比，靶向MSLN的CAR-T(CART-meso)显著抑制肿瘤生长，IFN-γ分泌水平更高，且在肿瘤缓解后更多的CART-meso细胞分化为记忆T细胞，并对胰腺癌异种移植小鼠的主要器官造成的损害最小[15]。I期临床试验已证明CART-meso细胞治疗的PDAC患者未出现细胞因子释放综合征或神经系统症状，且六分之二的患者病情稳定[16]。

尽管目前CAR-T疗法在胰腺癌治疗的探索已初见成效，但是临床试验的副反应却不容忽视。在一项临床试验中CEA特异性CAR-T细胞治疗不仅效果短暂，还会诱导急性呼吸道毒性，细胞因子过量释放使得IL-6水平显著升高[17]。而当非肿瘤组织毒性受到控制，有效性又成了桎梏，一项I期临床试验使用HER2特异性CAR-T细胞治疗两名胰腺癌患者，尽管该实验的安全性得到了证实，但其肿瘤杀伤效应一般[18]。为了兼顾靶向性和安全性，研究人员设计了一种带有抗体开关的HER2 CAR-T，它与常规HER2 CAR-T一样有效，这种“开关”是由肿瘤抗原特异性重组fab段剂量控制的，以调节CAR-T细胞活性的转换，因此带有开关的CAR-T可有效抵抗晚期PDAC患者肿瘤扩散，同时兼具开关控制的相对安全性[19]。

不容乐观的是，胰腺肿瘤常常采用免疫逃逸策略，比如产生抑制性细胞因子，从而限制CAR-T细胞的增殖与存活能力。为此，研究人员利用肿瘤来源的IL-4[20]、IL-8[21]、TGFβ[22]、IL-10[23]等，开发了阻断并逆转肿瘤来源的细胞因子抑制作用的CAR-T，使得CAR-T疗法成为能够克服肿瘤微环境免疫抑制以助于治疗PDAC的潜在方法。

2.3 结直肠癌(colorectal cancer，CRC)

目前CRC的常用临床试验靶点有CD133、CEA、EGFR、EpCAM及HER2，并分别取得了不错的成效。现有数据表明，CD133是复发或难治性恶性肿瘤的潜在治疗靶标，一项招募了23例患者(14例HCC，7例胰腺癌和2例CRC)的I期临床试验(NCT02541370)证实了CD133 CAR-T治疗CD133阳性晚期转移瘤的可行性、有效性和毒力可控性[24]。一项I期递增剂量试验(NCT02349724)纳入了10例CEA阳性转移性CRC患者，对其进行CEA CAR-T细胞疗法，结果显示即使是给予大剂量CEA CAR-T细胞治疗，患者依然耐受良好并且明显获益，外周血中CAR-T细胞持续增殖，多数患者的血清CEA水平也明显下降[25]。 CAR-T细胞通过靶向EpCAM可诱导对EpCAM+癌细胞的溶解性细胞毒性，并分泌包括INF-γ和TNF-α在内的细胞因子，在CRC异种移植模型中，EpCAM CAR-T治疗显著抑制了肿瘤的生长[26]。一项研究通过观察HER2特异性CAR-T细胞对异种移植肿瘤的治疗效果，发现HER2 CAR-T细胞具有渗入肿瘤组织并选择性清除HER2+CRC细胞的能力[27]

近三年来，CAR-T在CRC的治疗领域涌现出一批新的靶点。靶向鸟苷酰环化酶C(guanylyl cyclase C,GUCY2C)的CAR-T细胞可识别并杀死表达GUCY2C的人源性CRC细胞，在免疫缺陷的CRC异种移植小鼠模型中CAR-T细胞可持久存在，并表明人GUCY2C特异性CAR-T疗法可用于治疗GUCY2C阳性的转移性CRC[28]，另有研究也表明GUCY2C CAR-T细胞可以在免疫缺陷的小鼠模型中治疗转移性CRC[29]。一项I期试验用靶向肿瘤相关糖蛋白72的CAR-T(CAR-T72)对转移性CRC进行了治疗，发现患者血清中肿瘤相关糖蛋白72急剧下降，但CEA并未急剧下降，证明了CAR-T72细胞的相对安全性[30]。双皮质素样激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)可在CRC遗传的小鼠模型中标记肿瘤干细胞，靶向DCLK1的CAR-T目的在于根除CRC肿瘤干细胞，与对照组CAR-T相比，这种新型的DCLK1 CAR-T细胞毒性更强，CRC细胞中IFN-γ释放水平更高，肿瘤生长同比降低了约50%，证明DCLK1 CAR-T可以在体外诱导细胞毒性，并在体内抑制异种移植物的生长[31]。以上结果都表明，CAR-T细胞可在CRC 中发挥治疗作用，并在实体瘤的治疗中显示出巨大的潜力。

2.4 胃癌(gastric cancer，GC)

在过去的几年中，应用CAR-T治疗GC的临床试验靶点有MSLN、 EpCAM、CEA、MUC1、HER2和PSCA等。MSLN中的表位选择至关重要，Zhang等[32]构建了分别靶向MSLN的I区和III区的meso1 CAR-T与meso3 CAR-T，与meso1 CAR-T相比，meso3 CAR-T的CD107α、IL-2和TNF-α等细胞因子的表达水平更高，在GC小鼠模型中，meso3 CAR-T介导的抗肿瘤效应更强。靶向MSLN的CAR-T细胞在体外对GC细胞表现出强大的细胞毒性和细胞因子分泌能力，并显著抑制GC皮下移植瘤模型中肿瘤细胞的生长[33]。靶向PSCA的CAR-T细胞表现出与T细胞毒性相关的细胞因子增加，向体内的GC组织周围注射抗PSCA CAR-T细胞成功阻止了肿瘤进展，证实了抗PSCA CAR-T细胞的可行性及其抗GC的功效，提示PSCA CAR-T细胞用于治疗GC患者的临床应用潜力[34]。

NKG2D是NK细胞的强激活受体，也是T细胞的共刺激受体，靶向NKG2D的CAR-T细胞在体内可显著抑制GC异种移植物的生长，此外，顺铂可上调GC细胞中NKG2D配体的表达并增强NKG2D CAR-T细胞介导的细胞毒性[35]。另一项研究发现，靶向NKG2D配体的CAR-T细胞可裂解GC细胞系和腹水来源的人原代GC细胞，表明NKG2D配体特异性CAR-T细胞是治疗伴有腹膜转移的GC患者的潜在疗法[36]。

GC患者中有一些特异性表达的蛋白可以作为CAR-T设计的潜在靶标。胃特异性紧密连接蛋白18.2(Claudin18.2,CLDN18.2)属于紧密连接蛋白家族中的一种亚型，在所有GC患者中的阳性率近60%，即使是在GC转移病灶中同样有较高的表达水平，且研究观察到CLDN18.2特异性CAR-T细胞在CLDN18.2+GC异种移植模型中介导了肿瘤消退[37]。此外，超过1/3的GC患者叶酸受体1(folate receptor 1,FOLR1)在癌细胞表面过表达，但在正常组织中很少表达，现有研究也证明了FOLR1特异性CAR-T细胞可诱导多种细胞因子分泌促使FOLR1阳性的GC细胞死亡[38]。因此，这些在GC组织中高表达但在正常组织中低表达的特异性蛋白，或在CAR-T领域具有出色的GC治疗潜力。

2.5 其他消化系统肿瘤

目前胆管癌CAR-T治疗的靶点有CD133、EGFR和HER2。使用CAR-T鸡尾酒免疫疗法治疗晚期胆管癌患者，通过EGFR特异性CAR-T治疗获得了8.5个月的部分缓解，CD133 CAR-T治疗获得了持续4.5个月的部分缓解，但都伴随一些CAR-T相关副反应[39]。一项临床试验(NCT01869166)评估了EGFR-CAR T细胞疗法在EGFR+晚期胆道癌的疗效，在17位患者中，1位获得了完全缓解，10位病情稳定[40]。另一项I期临床试验(NCT01935843)评估了HER2特异性CAR-T免疫疗法在晚期胆道癌和胰腺癌患者中的安全性和可行性，11名患者中，1例有4.5个月的部分反应，5例病情稳定[41]。

目前已有以EpCAM(NCT03013712)和HER2(NCT00889954)为靶点进行CAR-T治疗食管癌的临床试验。肝配蛋白A型受体2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)是受体酪氨酸蛋白激酶家族中的一员，EphA2的表达在食管癌组织和细胞中显著上调，EphA2 CAR-T细胞表现出对食管癌细胞的剂量依赖性杀伤作用，并促进细胞因子的产生，为免疫疗法治疗食管癌开辟了一条新途径[42]。总体看来，CAR-T免疫疗法在一些发病率较低的消化系统肿瘤中的治疗卓有成效，但寥落晨星，要应用到临床尚且任重道远。

3 总结与展望

目前多项CAR-T治疗消化系统肿瘤的临床试验正在进行中，也涌现了一些振奋人心的临床结果，但依然面临着CAR-T治疗的特异性不够高、副作用较大和肿瘤微环境免疫抑制的挑战。为解决这一系列问题，很多学者着力于研究双靶点CAR-T，CAR-T联合化疗、放疗和其他免疫疗法的有效性和安全性。实体瘤具有丰富的肿瘤基质，CAR-T细胞必须渗透到肿瘤基质中才能发挥抗肿瘤作用，这可能解释了为何CAR-T疗法在实体瘤中的疗效不及血液肿瘤。CAR-T疗法的一个关键点是选择肿瘤特异性抗原，然而目前研究的大多数肿瘤抗原是肿瘤相关抗原，其虽在肿瘤细胞中高表达，但在正常组织中也有表达，因此攻击肿瘤组织的CAR-T细胞也会对正常组织或器官造成损害。对此我们在CAR-T设计优化方面提出一些见解：1)提高靶点选择的针对性和特异性；2)开发利用多靶点CAR-T技术，减少脱靶效应；3)利用细胞因子受体提高CAR-T细胞的趋化性；4)增强对肿瘤免疫抑制微环境的抵抗力；5)增强CAR-T的安全性，一些“开关”设计已被开发并用于患者，可选择性地控制CAR-T细胞的激活或失活，降低与CAR-T相关的副作用。

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