血液学生物标志物在肺癌免疫治疗中的研究进展*

柯萍，江波

650118 昆明，昆明医科大学第三附属医院 干部医疗科

肺癌是全世界死亡率最高的恶性肿瘤[1]。晚期肺癌的治疗继化学治疗、分子靶向治疗之后，进入以免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitor，ICI)为代表的治疗时代。尽管ICI改变了肺癌患者的治疗策略，但实际上获益人群仅占晚期非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的20%左右[2]。生物标志物可以标记机体生理状态，常被用来评估ICI抗肿瘤治疗的效果并指导临床用药，但是，临床现有的生物标志物并不足以满足筛选ICI获益群体的需求，因此需要进一步探索更明确的生物标志物。另外，目前临床应用的生物标志物多是通过肿瘤组织进行检测，然而组织病理活检具有一定侵入性，限制了用于监测治疗反应和治疗耐药性研究所需的重复采样的可能；同时，由于肿瘤异质性的存在，可能会遗漏重要的特征。外周血液与肿瘤有同源的基因，能有效克服肿瘤异质性，较为完整地反映原发肿瘤的基因突变状态，其检测技术因其非侵入性、操作简便等特点可以实现肿瘤实时监测及预后判断，因此，其中可能存在潜在的生物标志物[3]。本文通过归纳整理存在于外周血液的生物标志物，包括程序性死亡受体配体1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)、可溶性PD-L1(soluble PD-L1,sPD-L1)、血浆肿瘤突变负荷(blood tumor mutation burden,bTMB)、微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、突变基因、T细胞受体(T cell receptor,TCR)库、外周血免疫效应标志物和外周血细胞计数，介绍上述标志物在肺癌中的研究进展并讨论联合标志物的应用，以期为筛选血液学生物标志物指导临床免疫治疗提供参考。

1 PD-L1

程序性死亡受体1(programmed cell death protein 1,PD-1)主要由活化的T细胞表达，其配体PD-L1主要由肿瘤细胞表达,PD-L1与PD-1的结合能诱导与维持外周T细胞的耐受，是肿瘤免疫逃避的关键机制[4]。多个指南推荐肿瘤组织PD-L1可以作为指导肺癌ICI治疗的生物标志物[5-8]，但是由于空间和时间异质性，局部肿瘤组织PD-L1的表达量不能完整反映肿瘤的状态[9-10]。

循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)随血液循环播散到全身，导致肿瘤的转移，因此比组织样本更容易检测到PD-L1的表达。有研究检测了71个晚期NSCLC患者配对的肺癌组织和CTCs样本中PD-L1的表达水平，两者一致性达93%(CTCs的敏感性为55%，特异性为100%)，显示了通过CTCs监测PD-L1表达的可行性[11]。Tanizaki等[12]收集晚期NSCLC患者使用PD-1抑制剂纳武单抗(nivolumab)治疗前的外周血并分离CTCs，结果显示，无进展生存期(progression-free survival，PFS)<6个月组的患者CTCs中PD-L1表达水平明显要高于PFS>6个月组患者,反应了CTCs中PD-L1低表达水平对良好预后的评估作用。目前，经CTCs检测PD-L1的表达应用挑战较大，因精准富集一定数量的CTCs是必要条件，另外，由于缺乏规范的检测流程与质量标准，所以需要完善检测的重复性。

PD-L1是PD-1主要的配体，部分以sPD-L1存在于血液中[13]。22例使用PD-1/PD-L1抑制剂的患者的研究结果显示血液中sPD-L1的表达与肿瘤组织中PD-L1表达水平无相关性，sPD-L1低水平组的患者总生存期(overall survival，OS)明显延长[14]。Okuma等[15]检测39例使用nivolumab治疗的晚期NSCLC患者sPD-L1的表达水平，发现sPD-L1低表达组患者的OS高于高表达组(P=0.040)，客观缓解率(objective response rate,ORR)高于高表达组(59%vs25%，P= 0.0069)，但该研究未评估血浆sPD-L1水平与肿瘤组织标本中PD-L1表达水平之间的相关性。Costantini等[16]收集了43例nivolumab治疗前NSCLC患者的血浆,发现高水平sPD-L1的表达和低水平颗粒酶B的含量与不良的PFS和OS相关，该研究也显示sPD-L1的表达与相对应肿瘤组织标本中PD-L1的表达水平无关。上述研究均提示血浆sPD-L1的低水平表达可能是晚期NSCLC患者免疫治疗的独立预后因素。sPD-L1可简便易行地判断临床预后，但在其功能和释放机制上仍有争议，即血浆sPD-L1水平可能代表肿瘤组织中固有T细胞反应的程度或由PD-1 / PD-L1免疫检查点机制介导免疫抑制的程度；另外，目前尚无标准化的sPD-L1检测方法，就目前研究中使用的几种ELISA试剂盒，其阈值不同，评判标准也不统一。总之，sPD-L1作为潜在的免疫治疗生物标志物在未来仍需要进一步的研究。

2 bTMB

肿瘤突变负荷(tumor mutation burden,TMB)是指每百万碱基中检测出的体细胞基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误的总数。理论上TMB越高，新的肿瘤相关抗原越多，刺激产生免疫应答的可能性越大，治疗效果就越好。关于NSCLC的治疗，美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network,NCCN )指南推荐行免疫治疗的患者检测TMB[17]，然而，TMB的检测却受限于肿瘤组织的获取，研究发现可以通过存在于血液中的循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)检测TMB，即bTMB[18]。

Gandara 等[19]对两项大型临床研究中NSCLC患者血浆样本的bTMB进行回顾性分析，发现bTMB和组织TMB(tissue TMB,tTMB)的阳性一致率为64%，阴性一致率为88%,且bTMB 的含量与 PD-L1表达水平无关，在PD-L1高表达且bTMB≥16的患者中，PFS有明显延长(HR=0.38)，该研究也提示多种生物标志物的组合比任何单一生物标志物能更好地预测治疗效果。Chen等[20]收集PD-1抑制剂帕博利珠单抗(pembrolizumab)治疗的8例NSCLC患者的肿瘤组织及ctDNA同时检测TMB，结果也高度一致。Wang等[21]使用下一代测序(next generation sequencing,NGS)肿瘤基因板评估了NSCLC患者的bTMB，发现bTMB>6的患者PFS更长(HR=0.39,P=0.01)。这些研究显示了bTMB与tTMB的良好相关性，且有助于预测高bTMB患者对ICI的反应，但这些方法仍存在一些局限性。首先，不同的检测平台及检测方法使ctDNA的检测结果参差不齐，其次，目前用于确定bTMB的基因面板使用不同的序列和阈值，导致研究结果各不相同，所以，bTMB的准确性仍需大型Ⅲ期临床研究进行验证。

3 循环miRNA

miRNA通过多种方式调控基因表达，对肿瘤的生长、进展、转移和耐药性等每一个标志性事件都有非常重要的作用，体液和组织中的miRNA表达水平一致，且miRNA与肿瘤的分期及基因突变无关[22]，循环miRNA能稳定存在于血清及血浆中，因此引起了广泛的关注。

miR-215具有抑癌作用[23]，一项回顾性研究[24]对接受nivolumab治疗的晚期NSCLC患者血清行miRNA分析，结果表明七个miRNA(miR-215-5p、miR-411-3p、miR-493-5p、miR-494-3p、miR-495-3p、miR-548j- 5p和miR-93-3p)与患者OS>6个月显著相关。Boeri等[25]检测接受ICI治疗的NSCLC患者组织PD-L1的表达水平及计算由24种miRNA组成的血浆miRNA特征分类器(miRNA-signature classifier,MSC)的水平，发现MSC水平与患者ORR(P=0.0009)相关，MSC水平联合PD-L1表达水平则与患者PFS(P=0.0001)和OS(P=0.0002)相关，表明了血浆MSC水平联合肿瘤组织PD-L1的表达量，可以预测免疫治疗方案中ORR、PFS和OS较差的晚期肺癌患者。目前关于循环miRNA对ICI疗效预测的相关报道多是回顾性或小样本研究，需要更大型的独立验证队列进行前瞻性评估。循环miRNA检测的局限性在于检测方法对溶血敏感性的限制，另外，用于定量检测的基因选择上也不一致。

4 突变基因

肿瘤驱动基因通路和PD-1/PD-L1通路可能存在相互影响，研究显示表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、间变性淋巴瘤激酶等驱动基因突变患者接受免疫治疗具有更低的ORR[26]，因此ICI治疗需除外此类基因突变的患者。临床中突变基因在肺癌组织中的受检率并不高，通过血液学检测突变基因已在多项研究中得到证实[27-28]，中国临床肿瘤学会(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)指南也表示可通过外周血中的游离/循环肿瘤DNA(cf/ctDNA)进行 EGFR 突变检测[29]。有研究收集晚期NSCLC患者的ctDNA行NGS，13例基线检测到KRAS转化或TP53转化的患者显示出nivolumab治疗的临床获益，继续治疗直至疾病进展的病例中有8例患者STK11突变与TP53转化并存或STK11突变与KRAS转化并存，提示STK11突变是原发耐药驱动因素[30]。但目前关于免疫治疗疗效和突变基因在肺癌中的研究较少，没有确切证据证明有特定的癌基因与免疫治疗疗效有独立相关性。

5 TCR库

ICI可能在一定程度上影响和改变了机体免疫系统对抗肿瘤的能力，针对癌细胞的宿主免疫应答的激活包括通过克隆增殖性TCR识别新抗原[31]，因此基于TCR的生物标记可能会预测肿瘤对ICI的反应。之前有研究报道[32-33]抗PD-1治疗后外周血PD-1+CD8+T细胞的早期增殖与临床获益相关。因此,Han等[34]收集接受ICI治疗的NSCLC患者的外周血样本，对从PD-1+CD8+T细胞分离的TCR进行了测序，结果显示外周血PD-1+CD8+TCR的多样性可以预测抗PD-1/PD-L1治疗的临床获益。这些结果表明，外周血PD-1+CD8+TCR可能是ICI的疗效预测标志物，但此研究没有配对血液及肿瘤组织样本，不能更有力地说明结论，且样本量小，需要更大的队列研究证实。TCR测序预测免疫治疗疗效的潜在价值很高，但检测时机及检测方法仍是目前研究所要探寻的问题。

6 免疫效应标志物

癌细胞通过生长因子、趋化因子、白介素及其自身受体的复杂网络与微环境进行通讯，PD-1/PD-L1免疫治疗解除免疫抑制，下游一系列炎症因子,如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8等也可能发生相应的变化。所以，炎症因子可能是预测免疫治疗疗效的标志物。研究检测接受免疫药物治疗(pembrolizumab或nivolumab)的NSCLC患者诊断时和治疗开始后3个月时的细胞因子(IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6和IL-8)数值，结果显示细胞因子数值的增加与患者OS的延长明显相关[35]。但此研究中，样本较少，有一些患者在接受抗PD-1抑制剂治疗之前接受一线化疗，在二线使用PD-1抑制剂的背景下，常规化疗对细胞因子水平的影响仍然不明确。另有研究[36]示使用nivolumab或pembrolizumab的NSCLC患者治疗1周内血清IL-6和C-反应蛋白升高组的治疗有效率显著高于未升高组。上述研究均提示了免疫效应标志物与免疫治疗疗效相关，然而在研究时应排除并发炎症引起的假象的可能性，可考虑与炎症指标相结合，以区分与癌症进展相关的效应标志物的升高以及可能由炎性疾病(如并发感染或自身免疫不良事件)引起的升高。目前关于外周血细胞因子研究较多，但还没有定论。

7 血细胞计数

炎症细胞可促进肿瘤发展，故监测外周血细胞是值得研究的领域，全血细胞计数是最常见的实验室检测。一项使用nivolumab的晚期NSCLC患者的回顾性研究[12]表明，低水平中性粒细胞绝对计数(absolute neutrophil count,ANC)、高水平淋巴细胞绝对计数(absolute lymphocytes count,ALC)和高水平嗜酸性粒细胞绝对计数(absolute eosinophil count,AEC)的患者有较长的PFS及OS。该研究的局限性在于未设置未接受nivolumab治疗的患者，无法确定ANC，ALC和AEC是对nivolumab反应的一般预后标志物还是预测标志物。一项荟萃分析评估了1 700名用PD-1 / PD-L1抑制剂治疗的NSCLC患者血液中性粒细胞与淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)的预测和预后价值，表明接受PD-1 / PD-L1抑制剂治疗的NSCLC患者血液NLR升高与PFS和OS缩短相关[37]。Kim等[33]测量ICI治疗后7天的患者外周血PD-1+CD8+T细胞中Ki-67阳性细胞百分比，发现高比例的Ki-67阳性细胞有持久的临床获益。但外周血细胞计数容易受外界的干扰，筛选特异的细胞有助于提高预测的可靠性。

8 联合检测的意义及必要性

从目前临床应用结果看来，单一标志物的应用并不理想，多因素联合预测是未来研究的方向。 有研究根据PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的表达将肺癌患者分为四型：Ⅰ型(TIL+/PD-L1+)、Ⅱ型(TIL-/PD-L1-)、Ⅲ型(TIL+/PD-L1-)、Ⅳ型(TIL-/PD-L1+)，并评估上述四分法对接受ICI治疗的NSCLC患者的预测作用，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型患者的OS分别为35.3个月、36.9个月、未达到中位OS和13.9个月(P=0.11)，结果表明CD8+T淋巴细胞高的患者有较长的PFS和OS[38]。Park等[39]将患者的性别、ECOG评分、NLR、DNLR设计成ISEND计算模型，用nivolumab进行治疗，发现评分好的患者PFS明显延长(17.4月vs5.1月,HR=0.32,P<0.001)。以上研究均提示多因素联合预测的意义重大，未来应综合多维度特征，构建复合变量的预测模型是很有发展前景的。

9 总结及展望

综上，血液学标志物能极大地补充生物标志物筛选ICI获益群体的需要，然而现阶段血液学标志物的应用还存在局限性，血液采样和分析之间的时间应尽可能缩短，在低肿瘤负荷患者中，其血液中的生物标志物含量很低，这对检测技术的灵敏度要求很高。另外，目前免疫联合治疗优势越来越明显，那么，联合治疗模式下生物标志物的选择又可能不同，当前多是免疫单药治疗的相关研究，为此，未来应利用大数据进行更深地挖掘，单独或组合测试不同的生物标志物，统一化标志物检测技术，确定阈值，建立综合模型来预测治疗敏感性，开展大型的前瞻性临床试验进行验证。

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