水稻粒型调控研究进展

宋 露，何明良，刘颖湘，卜庆云，李秀峰，王臻昱，田晓杰

(中国科学院 东北地理与农业生态研究所，黑龙江 哈尔滨 150081)

0 引 言

水稻(OryzasativaL.)是重要的粮食作物之一，世界上一半以上的人口都以其为主食。影响水稻作物产量的三个要素分别是单株有效穗数、每穗粒数以及千粒重。而千粒重主要由粒型和灌浆程度决定，可见粒型是一个十分重要的产量性状。粒型主要由粒长、粒宽、粒厚以及长宽比所组成。在被子植物中，种子发育始于双受精事件，即二倍体胚和三倍体胚乳的形成[1]。种皮由母体的株被发育而来，包裹着胚和胚乳[2]。这三个结构相互交流，协调控制种子的生长和发育，从而决定种子的最终大小[2]。种子大小主要由母体和合子组织的遗传信息所控制，同时也受到生长环境因素的影响。在拟南芥中，一些调控因子通过调控胚乳生长来调控种子的发育[3-5]，这种情况下，种子的大小取决于合子组织(胚和胚乳)的基因型，而不受控于母体组织的基因型。另外，胚乳的生长也受到与表观遗传修饰相关的亲本效应的影响[6]。同时，来自于母体的种皮为胚和胚乳的生长提供空间[7-9]。而水稻种子最外层的颖壳是禾本科植物特有的器官，为水稻种子的生长设置了最大的上限。在水稻中，主要通过调控颖壳细胞的发育来调控水稻的粒型，主要包括泛素-蛋白酶体途径、G蛋白信号途径、丝裂原激活蛋白激酶信号途径、植物激素和转录因子等信号途径。本文总结了以上几种信号途径的研究进展，并重点阐述近年来新发现的几种调控因子的遗传和分子机制。

图1 水稻粒型信号调控网络Fig.1 Signal regulatory network of rice grain size

1 泛素-蛋白酶体途径

近年来，泛素-蛋白酶体途径被报道能够参与调控水稻种子的生长。GW2(GRAIN WIDTH AND WEIGHT 2)是一类RING型E3泛素连接酶，主要通过抑制水稻颖壳细胞的分裂和灌浆速率，负向调控水稻的粒宽和粒重[10]。同时，小麦和玉米的GW2同源基因也参与调控种子的大小，表明在粒型调控上，GW2在不同植物物种中具有功能保守性[11-14]。此外，最近的研究发现，GW2能够与谷氧还蛋白WG1(WIDE GRAIN 1)/OsGRX8相结合，通过泛素化修饰WG1/OsGRX8降低其蛋白稳定性，进而抑制颖壳细胞的分裂，负向调控水稻的粒宽和粒重，并建立GW2-WG1-OsbZIP47信号通路调控水稻粒宽和粒重的分子模型[15]。qSW5/GW5与GW2功能相似，通过抑制颖壳细胞的分裂，负向调控水稻的粒宽。GW5能够结合泛素分子，因此被认为通过泛素-蛋白酶体途径参与调控水稻的粒型[16]。同时，遗传学分析发现，在粒宽的调控上，GW2与GW5的功能是相互独立的[16]。另外，HECT型E3泛素连接酶LARGE2/OsUPL2也参与调控水稻的粒型，功能缺陷型突变体large2表现为粒宽、穗长、每穗粒数显著增加[17]。生化分析发现，LARGE2通过泛素化APO1/2降低它们的蛋白稳定性，负向调控水稻穗型和每穗粒数，但其参与调控水稻粒型的分子机制还没有被阐明[17]。此外，去泛素化蛋白酶WTG1/OsOTUB1也参与调控水稻的粒型，wtg1-1(wideandthickgrain1-1)突变体表现为粒宽、粒厚显著增加，粒长变短；而WTG1/OsOTUB1过表达转基因水稻粒厚、粒重降低、粒长增加，细胞学观察发现WTG1/ OsOTUB1通过调控颖壳细胞的延伸，参与调控水稻的粒型[18-19]。以上研究成果均表明，泛素-蛋白酶体途径在水稻粒型的调控上发挥重要作用。

2 G蛋白信号途径

G蛋白偶联信号通路，通过膜受体和由Gα、Gβ和Gγ亚基组成的异源三聚G蛋白复合物，将信号传递到下游效应器，参与调控植物的生长和发育。在拟南芥和水稻中，Gα和Gβ亚基缺陷型突变体粒长变短，说明Gα和Gβ亚基正向调控水稻的粒长[20-23]。蛋白Gγ亚基GS3(GRAIN SIZE 3)编码一个与拟南芥AGG3同源的非典型Gγ亚基，包含一个N端的类γ结构域和一个C端富含半胱氨酸的结构域，其第二外显子单核苷酸的替换C165A导致翻译提前终止，产生长粒，被水稻育种家广泛应用[24-25]。另一个等位基因编码含有N端γ样结构域的截短蛋白，缺乏C端富含半胱氨酸的区域，被认为是功能增强型等位基因，产生短粒[26]。DEP1(DENSEANDERECTPANICLE1)/qPE9(PANICLEERECTNESS)是水稻穗型的一个主效QTL基因，编码另一个非标准的Gγ亚基，它包含与GS3相似的N端和C端结构域。dep1/qpe9-1等位基因编码一个截短的蛋白质，包含完整的N端γ样结构域，和缺失大部分的C端富含半胱氨酸的区域，被认为是功能增强型等位基因，导致穗型直立、粒型变小、粒重降低[27-29]。最近的一项研究表明，DEP1过表达转基因水稻粒型增大，而DEP1基因的缺失或敲除产生小粒和直立穗[30]，进一步证实了DEP1/ qPE9正向调控水稻粒型的结论。GS3与DEP1/qPE9和GGC2(Gγ)竞争性结合RGB1(Gβ)，起着功能拮抗的作用[30]。DEP1与GGC2和RGB1相互作用正向调控水稻粒长，但GS3与DEP1和GGC2竞争性结合RGB1，从而抑制了该功能。GS3的降解受其C末端的影响，GS3的功能增强型等位基因编码的蛋白质缺少C末端，因此更稳定，竞争性结合RGB1的能力增强，因而产生极短的籽粒。遗传分析表明，在粒长的调控上，Gγ亚基的功能发挥依赖于RGA1(Gα)和 RGB1。RGA1 蛋白具有自激活，RGA1与RGB1-DEP1/GS3/GGC2二聚体的解离，受未知G蛋白偶联受体介导的生长信号所调节，解离的RGA1和RGB1-DEP1/GGC2二聚体可能会激活未知的下游效应子，通过促进颖壳细胞的分裂来调节水稻粒型；而GS3与DEP1/qPE9和GGC2竞争性结合RGB1，负向调控水稻种子的生长[31]。另外，MADS1被认为是G蛋白信号的下游效应器，参与调控水稻粒型。OsMADS1最后一个内含子的突变，导致其剪接缺陷，产生长粒，且OsMADS1的突变等位基因在水稻驯化过程中经历了人工选择[32]。DEP1和GS3能够与细胞核中的转录因子MADS1相互结合，提高其转录活性，促进下游基因的转录，从而抑制种子的生长[33]。而其他研究结果表明GS3与DEP1的功能相反[30]，因此对于这一结果存在较大争议，还需进一步研究和分析。此外，Gγ亚基RGG1和RGG2能够抑制水稻种子的生长，而RGG2功能缺陷型突变体促进了水稻种子的生长[33-34]。不同Gβ和Gγ亚基间的组合，在水稻粒型的调控上发挥着不同的生物功能，如RGB1/DEP1 和 RGB1/GGC2的二聚体能够促进水稻种子的生长[30]，而RGB1/RGG1和RGB1/RGG2的二聚体抑制了水稻种子的生长。未来的研究还需进一步挖掘更多的G蛋白复合物的上游信号元件、受体和下游效应器，以完善G蛋白信号途径调控水稻粒型的分子网络。

3 MAPK信号途径

植物丝裂原激活蛋白激酶MAPK(Mitogen activated protein kinases)信号途径，在多个信号转导通路中发挥重要功能，包括激素信号转导、粒型调控以及胁迫响应等[35-36]。MAPK级联信号途径一般包括三个以上的激酶，即MAPKs、MAPKKs(MAPK kinases)和MAPKKKs(MAPKK kinases)。SMG1(Small Grain 1)编码MAPK激酶OsMAPKK4，smg1突变体由于颖壳细胞分裂能力下降，形成小粒[37]。同样，OsMAPK6突变体dsg1(dwarf and small grain 1)也是由于颖壳细胞分裂能力下降，粒型变小；且OsMAPKK4与OsMAPK6能够相互结合，OsMAPK6是OsMAPKK4的磷酸化底物[38]。此外，OsMAPKKK10功能缺陷型突变体smg2-1(smallgrain2-1)颖壳细胞分裂能力下降，导致粒型变小；而组成型激活的OsMAPKKK10转基因水稻，颖壳细胞分裂能力显著提高，粒型变大[39]。OsMAPKKK10通过有序的磷酸化OsMAPKK4和OsMAPK6激活他们的激酶活性，正向调控水稻粒型[39]。而受体类似蛋白激酶OsER1(ERECTA 1)的突变体oser1表现为粒长增加、粒宽降低、每穗粒数显著增加的表型。遗传学实验分析发现，OsER1作用于OsMAPKKK10-OsMAPKK4-OsMAPK6级联信号通路的上游，负向调控水稻的每穗粒数[40]，但其参与调控水稻粒型的分子机制还没有被阐明。另外，OsMKP1(MAPK phosphatase 1)是MAPK信号的负调控因子，它通过使MAPK6发生去磷酸化作用，抑制其激酶活性，负向调控水稻种子的生长。OsMKP1功能缺陷型突变体，通过提高颖壳细胞的分裂能力，使其粒长、粒宽显著增加[39,41]；而OsMKP1过表达转基因水稻，由于颖壳细胞分裂能力降低，产生较小的种子。因此，MAPK6活性对于水稻粒型的调控起着非常重要的作用[39,41]。最近，水稻转录因子OsWRKY53被报道是OsMAPKKK10-OsMAPKK4-OsMAPK6级联信号通路的下游靶基因，参与调控水稻种子的生长[42-43]。OsWRKY53是OsMAPK6的磷酸化底物，OsMAPK6通过磷酸化OsWRKY53提高其生物功能[42]。OsWRKY53过表达转基因水稻颖壳细胞延伸和分裂能力显著提高，使得粒长、粒宽显著增加，相反的，oswrky53突变体颖壳细胞延伸和分裂能力都显著降低，因而种子变小[43]。虽然OsMAPKKK10-OsMAPKK4-OsMAPK6信号通路主要通过调控颖壳细胞的分裂来调节种子的生长，但调查发现，OsMAPK6组成型过表达转基因水稻粒型增大主要是由于颖壳细胞延伸能力提高所致，说明OsMAPK6主要调控细胞分裂，但在细胞延伸上也有一定的调控作用[43]。因此，OsWRKY53作为OsMAPKKK10-OsMAPKK4-OsMAPK6的微效靶基因参与调控水稻粒型的分子模型是成立的。

4 激素信号途径

植物激素在植物的生长、发育、胁迫响应以及代谢过程中发挥着十分重要的功能，油菜素内酯(Brassinosteroids)和生长素(Auxin)主要通过调控水稻颖壳的发育来调控种子大小。

在水稻和拟南芥中，BR功能缺陷型突变体和不敏感突变体形成较小的粒型，说明油菜素内酯能够促进种子的生长[44-49]。GS5是一个主要的粒型QTL基因，编码丝氨酸羧肽酶，通过调控颖壳细胞的分裂和延伸来调控种子的生长；GS5结合并抑制OsBAK1-7的内吞作用，正向调控BR信号和水稻粒型[31,50]。水稻OsPPKL1蛋白与拟南芥BSU1具有很高的序列同源性，参与调控细胞的伸长、分裂以及BR信号转导。OsPPKL1由一个粒长QTL基因qGL3/GL3.1所编码，OsPPKL1通过抑制颖壳细胞的扩增负向调控水稻粒型[51]。qgl3突变体在OsPPKL1的kelch结构域中发生了一个单碱基的替换，即364位的天冬氨酸突变成谷氨酸，导致粒长变长，作物产量提高[31]。OsPPKL1通过与细胞周期相关蛋白Cyclin-T1;3相结合，使其发生去磷酸化作用，抑制其表达，从而抑制粒长的生长。此外，近期的报道发现，qGL3/OsPPKL1还能够与GSK3/SHAGGY类似蛋白激酶OsGSK3相互作用，参与调控BR信号和水稻粒型。qGL3/OsPPKL1通过去磷酸化OsGSK3，提高其蛋白稳定性，负向调控水稻粒长和BR信号[52]。有意思的是，OsPPKL1 和 OsPPKL3负向调控水稻的粒长的生长，而OsPPKL2正向调控水稻粒长的生长[51]。另外，水稻BR受体OsBRI1也能参与对水稻粒型的调控，OsBRI1功能缺陷型突变体d61-1和d61-2，粒型显著变小，但其参与调控粒型的分子机制尚不清楚[53]。水稻GSK3/SHAGGY类似蛋白激酶OsGSK2是拟南芥BIN2的同源基因，组成型激活的OsGSK2转基因水稻产生较小的种子，而OsGSK2RNA干扰转基因水稻产生较大的种子[54]。OsGSK2通过与多个底物蛋白相互结合，参与调控水稻的粒型。首先，OsGSK2直接与转录激活子GS2(GRAIN SIZE 2)/OsGRF4(GROWTH-REGULATING FACTOR 4)结合抑制其活性，说明OsGSK2可能通过OsGRF4-GRF-OsGIFs(INTERACTING FACTORs)调控模型参与调控水稻粒型[31]。其次，OsGSK2可调节GS9(GRAIN SHAPE GENE ON CHROMOSOME 9)的转录活性。GS9 是一种转录激活子，与OsOFP8和OsOFP14形成转录复合物，通过调控颖壳细胞的分裂，参与调节水稻种子的生长，OsOFP8 能够抑制GS9的转录活性，而OsGSK2能够减弱这种抑制作用[55]。另外，OsGSK2通过磷酸化GRAS家族蛋白DLT(DWARF ANDLOW-TILLERING)介导调控BR信号和水稻粒型，DLT过表达转基因水稻表现为粒长增加、粒宽和粒厚显著降低的表型[54,56-57]。此外，OsGSK2还通过磷酸化LARGE1/OML4(MEI2-LIKE PROTEIN4)提高其蛋白稳定性，负向调控水稻的粒型和粒重。OML4功能缺陷型突变体粒型增大、粒重增加；而OML4过表达转基因水稻粒型变小、粒重降低，OML4通过抑制颖壳细胞的延伸来负向调控水稻种子的生长[58]。

最近，水稻转录因子OsWRKY53被报道是OsGSK2的一个新的靶基因，OsGSK2通过磷酸化OsWRKY53降低其蛋白稳定性，负向调控水稻种子的生长。oswrky53能够部分抑制OsGSK2-RNAi粒型增大的表型 ，且二者主要通过调控颖壳细胞的延伸来调控水稻种子的生长[43]。此外，OsGSK2还能够通过磷酸化MAPKK4，抑制其激酶活性，参与调控水稻的粒型，但二者之间的遗传关系及调控机制尚不清楚[43]。另外，近年的报道发现，qSW5/GW5通过结合并抑制GSK2的激酶活性，使去磷酸化形式的BZR1和DLT在细胞核内大量积累，正向调控水稻的粒宽和粒重[59]。而GSE5是qSW5/GW5相应基因座号下的另一开放阅读框，编码钙调素结合蛋白，通过抑制水稻颖壳细胞的分裂，负向调控水稻的粒宽。GSE5/GW5启动子区的自然变异，为水稻的粒型多样性做出贡献。与窄粒籼稻品种相比，大多数宽粒籼稻品种在GSE5/GW5启动子中具有950 bp的缺失(DEL1)，而大多数粳稻品种具有1 212 bp的缺失(DEL2)，这些缺失导致GSE5/GW5表达量降低，促进了颖壳细胞的分裂，使粒宽和粒重增加。相比之下，GSE5/GW5的过量表达产生了窄粒。DEL1和DEL2等位基因分别广泛应用于籼稻和粳稻的育种[60]。生长素信号被Aux/IAA(Auxin/INDOLE-3-ACETIC ACID)转录抑制子和ARF(AUXIN RESPONSE FACTOR)转录因子所介导[61]。OsSK41(SHAGGY-like kinase 41)/OsGSK5与OsARF4相互作用，参与调控水稻的粒型和粒重[62]。OsSK41/OsGSK5由粒重主效QTLqTGW3/GL3.3所编码[62-64]，OsSK41可以磷酸化OsARF4，通过抑制颖壳细胞的延伸，负向调控水稻的粒宽和粒重，二者的功能缺陷型突变体均表现为粒型增大、粒重增加。由于OsSK41和OsARF4能够调控生长素响应基因的表达，表明OsSK41和OsARF4可能通过调控生长素信号来调控水稻粒型。另外，生长素运输也参与调控水稻的粒型，BG1(BIG GRAIN 1)是一个膜定位蛋白，在水稻茎的维管组织和幼穗中表达量较高。功能获得型突变体bg1-D，表现为生长素向基质运输增加、生长素分布改变和超大粒型，细胞学观察发现bg1-D颖壳细胞分裂能力和延伸能力均显提高[65]。此外，中央细胞的受精作用导致生长素的产生，生长素被输出到母体组织中以促进种皮的发育，合子组织缺陷性生长素输出也会影响母体组织的生长和种子的大小[66]。

5 转录因子调控途径

转录调控在植物的生长、发育过程中发挥着至关重要的作用。目前，有多个转录调控因子参与调控水稻种子的生长，包括转录因子、转录共激活因子以及参与染色质修饰的调控因子。GLW7(GRAINLENGTHANDWEIGHTONCHROMOSOME7)是一个粒型的主效QTL，编码OsSPL13基因[67]。OsSPL13通过促进颖壳细胞的延伸，正向调控水稻粒型。OsSPL13能够结合到SRS5启动子上促进其转录，SRS5突变体粒长变短，而SRS5过表达转基因水稻粒长变长[68]。GW8是粒宽的主效QTL，编码OsSPL16基因，OsSPL16通过促进颖壳细胞的分裂正向调控水稻粒型[69]。GW7(GRAINWIDTH7)/GL7(GRAINLENGTHONCHROMOSOME7)/SLG7(SLENDERGRAINONCHROMOMSOME7)是水稻粒型的另一主效QTL，其启动子区的突变，导致GW7/GL7/SLG7高表达，产生窄且长的粒，这一有益基因也被广泛应用于水稻育种[70]。OsSPL16可直接结合到GW7/GL7/SLG7启动子上抑制其表达[70]，二者可能在同一遗传通路上调控水稻粒型。有研究发现GW7/GL7/SLG7分别通过促进和抑制粒长和粒宽方向上颖壳细胞的分裂，参与调控水稻粒型[70]。相反的，另一研究发现GW7/GL7/SLG7分别通过促进和抑制粒长和粒宽方向上颖壳细胞的延伸来调控水稻粒型[71]。对GW7/GL7/SLG7和OsSPL16相关突变体的种子进行进一步的细胞学分析，可能有助于解决这一问题。GS2/GL2(GRAIN-LENGTH-ASSOCIATED2)/PT2(GLW2/PANICLETRAITS2)是也水稻粒型的主效QTL，编码转录因子OsGRF4基因，主要通过促进颖壳细胞的延伸和分裂，正向调控水稻的粒型[72-76]。OsmiR396能够与OsGRF4结合并抑制其表达，将OsGRF4中OsmiR396的靶点突变后，水稻粒型显著增大。此外，OsGRF4还能够与共激活转录因子OsGIF1/2/3相结合，OsGIF1过表达转基因植株形成大粒[72-73,75,77]。因此，OsmiR396-OsGRF4-OsGIFs模型在水稻粒型的调控上发挥重要作用。AP2型转录因子SMOS1(SMALL ORGAN SIZE 1)作为生长素依赖的调控因子，通过直接调控细胞延伸调控基因OsPHI-1(PHOSPHATE-INDUCEDPROTEIN 1)的表达参与调控水稻粒型[78]。而近期的研究发现，SMOS1可以与DLT形成复合物，调控BR信号反应和水稻粒型，表明SMOS1介导了生长素和BR之间的信号交流[54,79]。碱性螺旋-环-螺旋转录因子An-1(Awn-1)参与调控水稻芒和粒长的发育，An-1上调表达后产生较长的芒和粒长，而An-1RNA干扰转基因水稻的芒和粒长显著变短，An-1主要通过促进颖壳细胞的分裂参与调节水稻的粒型[80]。此外，粒型QTL基因GW6a(GRAINWEIGHTONCHROMOSOME6a)编码组蛋白H4乙酰化转移酶OsglHAT1。OsglHAT1通过促进颖壳细胞的分裂，正向调控水稻粒型[81]。由于OsglHAT1影响了组蛋白H4的整体乙酰化水平，说明染色体修饰也参与调控水稻的粒型。

6 展望

种子大小受复杂网络信号的调控，该网络整合了多种发育和环境信号。尽管最近的研究已经确定了一些关键的水稻粒型调控因子和信号途径，但我们对完整调控网络的了解仍然有限。探索已知粒型调控基因的上下游组件，以及阐明现有调节途径之间可能存在的联系，完善水稻粒型调控网络，将是未来研究工作的一项巨大挑战。通过将传统研究方法与现代高通量方法(如表型组学、代谢组学、蛋白质组学和全基因组关联研究)相结合，可加速这一研究的进程。此外，相同的基因或等位基因对水稻的细胞增殖、细胞延伸以及作物产量的影响可能不一致，一个可能的原因是研究人员经常使用可能具有多个其他突变的近等基因系，进行遗传和生理分析。而基因组编辑技术提供了一种在相同遗传背景下生成特定突变体的便捷方法，将有助于解决这一问题。

种子大小通常与种子的数量呈负相关，显然，植物在漫长的进化过程中对这两个性状进行了平衡，但平衡每穗粒数和种子大小之间的分子机制尚不清楚，这也将是未来研究工作的一项挑战。另外，种子大小在不同植物物种之间具有很大的差异，挖掘不同植物物种间粒型差异的关键基因，可以从进化上对粒型调控的分子机制进行深层次的理解，这可能可以通过综合分析大规模遗传和基因组数据来实现。从进化角度上，探究粒型衍化和进化特征，对于粒型调控机理的阐明，是一种新的启发和便捷手段。随着一些粒型有益等位基因的挖掘和鉴定，这些等位基因如何被人为组合应用到育种上，为水稻作物产量的提高做出贡献，也是育种学家面临的挑战。这就需要挖掘出更多的粒型调控元件，最终将各个元件，点成线，线成网。水稻粒型调控网络的阐明，必会对作物产量的提高做出巨大贡献。