环状RNA在眼部增生性疾病中的研究进展

杨天静，沈 轶

0引言

非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)是一类不参与编码蛋白质的RNA，此类RNA占据人类RNA序列的绝大多数[1]。过去ncRNAs一直被视为转录过程中的垃圾分子，但随着研究的进展和技术的革新，研究人员对ncRNAs的认识逐步深入，发现此类RNA可以通过参与表观遗传水平上的调控来调节生物体的生长发育，因此其鉴定与功能也越来越受到广泛关注。环状RNA(circular RNA，circRNA)是一种在真核生物中广泛存在的内源性ncRNAs。越来越多的研究表明，circRNA具有重要的生理病理功能，可以参与调节细胞增殖、分化和凋亡等过程，也可以参与多种疾病的发生发展，包括动脉粥样硬化、心肌肥厚与心力衰竭等心血管疾病及阿尔兹海默症[2]、急性髓细胞性白血病[3-4]、骨肉瘤[5-6]、肺癌和结直肠癌[7-9]等。近年研究发现，circRNA可通过调节血管新生等病理过程参与多种眼部增生性疾病的发生发展。本文就circRNA的概念、分类、作用机制及其在多种眼部增生性疾病包括增生性玻璃体视网膜病变、糖尿病视网膜病变、年龄相关性黄斑变性等中的研究进展进行综述。

1 circRNA的概述

1.1 circRNA的概念Coca-Prados等首次在真核细胞中发现circRNA[10]。由于其表达丰度较低，既往研究普遍认为circRNA是剪切或错误剪切过程的产物[11]。随着对circRNA分子算法的改进和高通量测序等先进技术的出现，越来越多的研究开始关注circRNA的鉴定及其功能。目前研究认为circRNA在哺乳动物体内广泛存在，并参与多种生物学功能的调控[12-13]。与线性RNA不同，circRNA通过反向剪切形成单链共价闭环结构，长度为100nt～4kb[14-15]。此类RNA不存在 5’帽子端和3’多聚腺苷酸(Poly A)尾，更易抵抗核酸外切酶的降解作用，因此结构更稳定。研究发现多数circRNA的半衰期比其同源线性RNA的半衰期更长[16-18]，可达数小时至数天，且在未分化细胞中尤为明显[19-20]。多数circRNA具有时空特异性和高度保守性，这些特性和特殊结构也提示了其可能在细胞分化、组织稳态及疾病的发生发展等过程中发挥重要作用。

1.2 circRNA的分类尽管多数circRNA由外显子组成，但也有部分circRNA来源于内含子、基因间区、非编码RNA及其反义非编码RNA基因座[21]。根据序列来源的不同可将circRNA分为外显子环状RNA(exonic circular RNA， ecircRNA)、内含子环状RNA(intronic circular RNA，ciRNA)以及外显子和内含子共同来源的环状RNA(exonic circular RNA with introns，EIciRNA)。

1.3 circRNA的作用机制

1.3.1 miRNA分子海绵与其他ncRNAs相似，circRNA也含有微小RNA(microRNA，miRNA)结合位点， 许多circRNA含有单个或多个miRNA结合位点，甚至参与调控整个miRNA家族的功能[22]。此类RNA可以作为竞争性内源RNA(ceRNA)，通过“海绵吸附”作用调控miRNA下游靶基因的表达。研究发现，不是所有circRNA与miRNA的结合均能导致后者活性与功能的抑制，circRNA也有可能充当miRNA的储存库，促进miRNA的转运。CDR1as[23]是最典型的circRNA，具有明显的组织特异性，主要在人和鼠的脑组织中表达，其含有72个miRNA结合位点。Piewecka等[24]发现在CDR1as敲除鼠的脑组织中，miR-7的含量明显下降。而其他研究认为CDR1as与miR-7的表达水平呈负相关[25]，这表明CDR1as对miR-7的调控作用可能与细胞及其所处外环境有关。

1.3.2调控基因转录研究表明，ecircRNA主要位于细胞质中[26]，其在核内剪切后转运至细胞质，或在细胞分裂过程中从细胞核逃逸。与ecircRNA相比，ciRNA的miRNA结合位点较少且主要位于细胞核内，此类circRNA可与RNA聚合酶Ⅱ结合，从而参与顺式转录调控[14]。部分EIciRNA除在转录位点附近聚集，还可在其他区域点状富集，提示EIciRNA可能参与反式调控过程。

1.3.3与RNA结合蛋白相互作用circRNA可以吸附蛋白分子，直接调控蛋白的功能。Ashwal-Fluss等[27]发现circMbl及其侧翼内含子均含有盲肌样结合蛋白(muscleblind-like protein，MBNL)结合位点，MBNL1可与circMbl蛋白结合，促进后者的生成，因此认为过量的MBNL1可以促进circRNA的生成进而抑制mRNA的生成。此外，前文提到的CDR1as可依赖miR-7与miRNA效应分子Argonaute(AGO)结合，参与基因的调控[23]。

1.3.4作为翻译模板研究表明，某些circRNA可被核糖体翻译并编码蛋白质，但目前此功能只在少数内源性circRNA得到证实[28-31]，如circZNF609、circMbl、circ-FBXW7、circSHPRH等。多数circRNA编码的多肽相关功能仍不清楚，但研究人员认为此类多肽可能充当蛋白变体，参与调节其他蛋白复合物的生成过程。

2 circRNA与眼部增生性疾病

2.1 circRNA与增生性玻璃体视网膜病变增生性玻璃体视网膜病变(proliferative vitreoretinopathy，PVR)常发生于眼外伤及孔源性视网膜脱离，是创伤后视网膜和玻璃体的异常愈合与修复反应。在此过程中，黄斑前膜形成，其收缩引起视网膜牵拉及褶皱，再次引发视网膜脱离，从而导致患者视功能下降甚至失明。

Yao等[32]通过基因芯片微阵列分析发现，在30例PVR患者的黄斑前膜样本中有91种异常表达的circRNA。研究者经实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)验证发现有8种表达下调和7种表达上调的circRNA，其中circ_0043144的异常表达水平最为明显。通过建立沉默载体干预人视网膜色素上皮细胞(human retinal pigment epithelial cells，ARPE-19)观察circRNA功能缺失对细胞功能的影响，结果发现circ_0043144的表达沉默可减少ARPE-19细胞的增殖和迁移能力，进一步表明circ_0043144的异常表达可能在PVR形成过程中起到关键作用。

2.2 circRNA与糖尿病视网膜病变糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)是最常见的糖尿病微血管并发症，是全球青壮年人群视力丧失的最主要原因[33]。DR的基本病理变化包括血-视网膜屏障破坏、视网膜水肿和出血、继发性视网膜新生血管生成等。DR的发病机制与氧化应激、炎症等密切相关。近年研究发现，表观遗传修饰对DR的发生有重要影响，ncRNAs作为表观遗传的调节机制之一，也引起研究人员的广泛关注。

研究发现，在DR患者的血清样本中有30种circRNA的表达明显上调[34]。circ_0005015在DR患者的血浆、玻璃体及视网膜纤维血管增殖膜样本中均有异常表达，circ_0005015沉默可以明显抑制人视网膜微血管内皮细胞的出芽、迁移和成管能力[35]。此外，研究发现，circHIPK3可以吸附miR-519-3p进而调控基质金属蛋白酶-2(matrix metallo proteinase-2，MMP-2)、信号转导及转录激活蛋白3(signal transducer and activator of transcription 3， STAT3)与X连锁凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)的表达影响细胞功能。在链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠模型中，circHIPK3沉默可以减轻无细胞毛细血管的形成和血管渗漏等视网膜微血管功能障碍[36]，为circRNA在血管生成和维持内皮细胞功能中的调控作用提供了依据。在视网膜毛细血管中，周细胞和毛细血管内皮细胞共同参与维持微血管系统的稳定性，两者由共同的基底膜包绕，周细胞位于毛细血管外周，其丢失为DR最早期的病理改变。Liu等[37]研究发现，在高糖或高氧胁迫刺激下，cPWWP2A在周细胞内表达明显上调，而在内皮细胞中的表达水平没有明显变化。沉默该circRNA可以抑制周细胞的增殖、迁移能力，用高糖处理过的周细胞培养液与内皮细胞共培养可使内皮细胞的迁移和成管能力增强，表明周细胞可能通过旁分泌的cPWWP2A调控内皮细胞的功能。在体实验中，cPWWP2A沉默引起视网膜无细胞血管和血管渗漏增多，炎症反应增强，且周细胞在视网膜毛细血管系统中的覆盖率降低。该研究再次证实了内皮细胞与周细胞之间的相互作用关系，并为circRNA对周细胞功能的调控以及其对内皮细胞功能的间接作用提供了新的研究思路。上述研究表明，circRNA参与DR早期及晚期的发生发展过程，因此可以作为诊断DR的潜在生物标记物和治疗DR的分子靶标。

2.3 circRNA与年龄相关性黄斑变性年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration，ARMD)是中老年人群中主要的致盲性眼病之一，随着人口老龄化加剧，ARMD的患病率呈明显上升趋势[38]。ARMD分为萎缩性和渗出性两种类型，渗出性ARMD的特点为出现新生血管并渗入视网膜色素上皮层下。由于形成的脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)尚不成熟，结构不完整且易渗漏，较易引起视网膜及视网膜下水肿、出血以及一系列瘢痕性改变，因此该型更容易导致严重的视力损伤。

Liu等[39]研究发现，在激光诱导的CNV小鼠模型的脉络膜组织中，有2种异常高表达和4种异常低表达的circRNA。基因本体论(gene ontology，GO)分析显示，这些circRNA定位于细胞核，参与免疫应答和神经传递等生物过程，KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路分析表明信号富集于细胞外基质受体(extracellular matrix receptor，ECM-receptor)相互作用途径及趋化因子信号通路。这说明CNV的发生发展过程与众多circRNA的异常表达有关，这为渗出性ARMD的相关研究提供了新思路。此外，Zhou等[40]研究发现，在激光诱导的CNV小鼠模型的脉络膜组织中，cZBTB44的表达水平明显上调，经体外实验证明cZBTB44表达沉默可以降低内皮细胞的活力，减少增殖，降低迁移和成管能力，在低氧胁迫情况下也表现出相同的结果。在体实验结果表明，在激光诱导的CNV小鼠模型中，沉默cZBTB44的表达可以抑制小鼠CNV的发生发展。该研究认为，cZBTB44可以充当miR-578海绵来抑制后者对CNV的负向调控作用从而参与血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor，VEGFA)及血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)的表达调控，最终诱导CNV的发生和发展。因此，cZBTB44对CNV的形成和靶向治疗具有重要的参考价值。

2.4 circRNA与早产儿视网膜病变早产儿视网膜病变(retinopathy of prematurity，ROP)是一种以视网膜缺血缺氧、新生血管增殖伴纤维化改变为特点的早产儿眼底疾病。随着医疗水平的发展，早产儿成活率增高，ROP已成为发达国家儿童失明的重要原因。随着对ROP研究的不断深入，近年关于ROP的相关临床与基础研究也越来越多。

Yang等[41]通过生物信息学分析预测出两种可能参与ROP病理过程的circRNA。Cao等[42]经基因芯片微阵列分析及qRT-PCR发现在氧诱导的小鼠视网膜病变模型的视网膜中有4种circRNA明显异常表达，并绘制了ceRNA调控网络，说明circRNA-miRNA-mRNA之间的相互作用具有复杂多样性。但circRNA在ROP中的研究还不多，而且以上两项研究样本量有限，可能会出现统计误差，因此仍需进一步探讨。

2.5 circRNA与角膜新生血管角膜新生血管是指在感染性角膜炎、创伤、化学烧伤和自身免疫性疾病等病理情况下从角膜缘血管网生成并向角膜基质延伸的新生血管[43]。角膜的无血管性是维持其生理功能的结构基础，过多的新生血管可能会严重影响患者的视功能。目前，角膜新生血管的治疗主要是应用糖皮质激素及非甾体抗炎药，但治疗效果欠佳，circRNA的研究可能会为角膜新生血管的治疗带来新的方向。

研究发现，在碱烧伤小鼠模型的角膜样本中有200多种异常表达的circRNA[44]，随机抽取其中20种通过qRT-PCR验证发现8种表达下调和8种表达上调的circRNA，其中cKifap3与cZFP609的异常表达最明显。此外，此研究还发现在化学烧伤及角膜炎患者的角膜样本中cKifap3的表达水平明显下调，cZFP609的表达水平明显上调。体外研究证实cKifap3表达沉默可以增强人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和成管能力，表明cKifap3与cZFP609可能参与调控角膜新生血管的形成。此外，研究表明，cZFP609可以吸附miR-184通过干预Akt和VEGF信号通路参与角膜新生血管的形成[45]。

3总结与展望

ENCODE计划[46]使得人们对ncRNAs有了新的认识，目前已知的circRNA已超过30 000个[47]，但多数circRNA的起源、特征与生物学功能还未得到阐明。此类RNA是人体内重要的调控分子，可参与多种病理生理状态的复杂调节过程，因其结构稳定且具有高度保守性和组织特异性等特点，circRNA逐渐成为研究的热点。circRNA在肿瘤、心血管领域的研究已取得诸多进展，但与眼部疾病的相关研究还不多，且多局限于离体水平，因此亟需建立更多系统有效的研究方法与动物模型。随着circRNA数据库的建立、生化方法和二代深度测序的迅速发展，相信circRNA将为眼底新生血管及其他相关增生性眼病的病因学及治疗学提供新的研究方向及理论基础，并为开发治疗眼部增生性疾病提供新的药物治疗靶点和新思路。