基于网络药理学探讨槲皮素治疗IPF的分子机制

张明昌，陈 威，谌小军，李 敏，葛正行

(1.贵州中医药大学 研究生院，贵阳 550000；2.贵州中医药大学 第二附属医院，贵阳 550000)

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种常见的以气道重塑、慢性炎症、肺泡破坏和纤维化为特征的致死性间质性肺病[1]，主要表现为进行性的呼吸困难和肺功能恶化，最终因呼吸衰竭而死[2]，其发病率高、生存率低、预后不良，已成为危害人类健康的主要疾病，寻找有效可靠的治疗药物是目前亟待解决的问题之一.目前仅有吡非尼酮和尼达尼布被批准用于治疗IPF[3-4]，但研究显示吡非尼酮对延长IPF患者生存时间的作用并不理想[5].此外，巨大的经济负担已成为IPF患者治疗的阻力[6].

近年研究显示中医药治疗IPF具有良好的疗效及安全性[7].槲皮素是自然界广泛存在的黄酮类化合物中的一种，可从多种中草药中进行提取，具备广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗血小板聚集、抗氧化应激以及抗感染等，此外大量实验研究表明其还具有显著的抗肺纤维化的重要作用.槲皮素可恢复衰老的IPF成纤维细胞对促凋亡刺激的敏感性，有效降低博来霉素致小鼠肺纤维化程度，减缓肺纤维化进程，减轻肺部病理损伤，保护肺脏[8-9].因此，槲皮素具有一定防治IPF的药理基础，但其产生作用的有效成分及作用于IPF的通路、靶点尚不清楚.网络药理学是基于系统生物学理论，对“药物、疾病、基因、靶点”进行网络分析，挖掘药物治疗疾病多靶点的内在联系的新学科，主要以系统生物学、多向药理学及计算机分析技术为基础，通过构建“成分-靶点-通路”网络，可整体系统地分析药物成分与疾病之间的相互作用关系，从分子生物学层面多方位揭示中药有效成分治疗疾病的潜在作用机制，对药物作用机制研究以及中药新药创新研发具有重要意义[10].因此，本研究拟采用网络药理学方法对槲皮素治疗IPF的作用机制进行研究，并通过分子对接技术验证化合物-潜在靶点的对接活性，为后期的临床研究以及新药研发提供理论支持.

1 材料与方法

1.1 获取槲皮素结构及靶点信息

从PubChem数据库[11](pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)中下载槲皮素的3D-sdf格式及Canonical SMILES号，将其分别导入Swiss Target Prediction数据库[12]、Targetnet数据库[13]进行靶点预测，根据可能性(probability)大于0进行筛选，合并去重后得到槲皮素的相关靶点蛋白，利用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将靶点蛋白转换为对应的人源性基因名，方便进一步的数据分析.

1.2 IPF相关疾病基因获取及槲皮素治疗IPF潜在靶点预测

OMIM(https://omim.org)、DISGENET(http://www.disgenet.org/home/)、比较毒物基因组学数据库[14](CTD)等数据库中检索疾病相关靶点，输入关键词为“idiopathic pulmonary fibrosis”，合并去重后获得与TPF相关的靶点基因.将药物靶点及疾病靶点导入Venny2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny)获取两者的交集基因，视为槲皮素治疗IPF的潜在靶点基因.

1.3 交集基因蛋白相互作用网络构建及核心节点网络筛选

将槲皮素治疗IPF的潜在靶点基因导入String数据库[15]，限定物种为人，去除游离基因后得到交集基因的蛋白相互作用(protein-protein interaction,PPI)网络，保存其TSV格式文件，并导入Cytoscape3.7.1软件[16]进行可视化及网络拓扑结构分析，以degree值反映基因作用大小，并根据degree值大小获取核心节点网络.

1.4 GO功能注释和KEGG通路富集分析

将交集基因导入功能注释生物信息学分析平台DAVID数据库[17]进行生物过程、分子功能、细胞组分的GO功能富集分析和KEGG通路富集分析.将所得结果根据P值降序排列(P<0.05)，并取基因富集数最多的前20条信息进行可视化.

1.5 构建“化合物-靶点-通路-疾病”网络

将槲皮素、交集基因及相关通路信息导入Cytoscape3.7.1软件，构建化合物-靶点-通路-疾病网络.该网络中，节点代表化合物、靶点、通路及疾病，连线代表节点之间的相互作用.经拓扑网络分析后采用degree值评判节点在网络中的重要性，degree数越大者，说明其网络中的相关性越大、重要性越强.

1.6 分子对接

将化合物-靶点-通路-疾病网络中节点度数最高的前3个靶点作为受体，将其与槲皮素进行分子对接，以验证槲皮素与靶点蛋白的结合活性.从PDB蛋白结构数据库(https://www.rcsb.org/)中获得核心靶点受体的人源性蛋白及其配体复合物，将从PubChem数据库中下载的槲皮素的3D-SDF结构则作为配体，利用PyMOL软件去除靶蛋白的水分子、配体，将SDF三维结构转换为PDB格式，用AutoDock Tools对受体和配体进行预处理后保存为PDBQT格式待用.最后利用AutoDock Vina软件[18]对配体及受体进行分子对接.

2 结果与分析

2.1 槲皮素潜在靶点的获取

通过PubChem数据库中获得槲皮素的结构信息，如表1、图1所示.从Targetnet、Swiss Target Prediction数据库中筛选出IPF靶点并利用Uniprot数据库校对后，合并去重后得到185个潜在靶点基因.按照相关性(Probability>0)进行排序，选取前15个基因名称和靶点展示，如表2所示.

表1 槲皮素的结构信息

表2 槲皮素排名前15的潜在靶点

2.2 IPF疾病基因及槲皮素治疗IPF潜在靶点

从OMIM、DISGENET、CTD数据库中获取IPF相关基因靶点共有3 995个.将IPF疾病基因与槲皮素靶点基因通过Venny映射筛选出共同靶点105个，将其视为槲皮素治疗IPF的潜在靶点基因，如图2所示.

图1 槲皮素的2D分子结构图图2 槲皮素与IPF靶点韦恩图

2.3 槲皮素治疗IPF潜在靶点的PPI网络

将String数据库得到的蛋白相互作用PPI信息的“TSV”文件导入Cytoscape 3.7.1软件制作PPI网络图，共涉及102个节点，780条边，如图3所示.其中节点表示蛋白质，边表示蛋白质与蛋白质之间的相互作用关系，该网络中超过2倍中位数degree值(18)的靶点蛋白有26个，如表3所示，视其为核心靶点蛋白，说明上述靶点很可能是槲皮素治疗IPF的关键.

图3 槲皮素治疗IPF潜在靶点PPI网络

表3 槲皮素治疗IPF的核心靶点

2.4 GO和KEGG分析

基于DAVID数据库，对105个交集靶点进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析(P<0.05)，通过微生信在线作图网站将分析结果进行可视化，结果显示：GO功能富集分析得到GO条目327条(P<0.05)，其中生物过程(BP)条目216条，包括：蛋白质自身磷酸化、RNA聚合酶Ⅱ启动子对转录的正向调控、氧化还原过程等；细胞组成(CC)条目40条，包括：细胞质、核浆、线粒体、细胞外区域等；分子功能(MF)条目71条，包括：蛋白结合、ATP结合、酶结合、蛋白激酶结合、蛋白激酶活性相同蛋白结合、蛋白酪氨酸激酶活性等，选取富集基因数最多的前10条条目进行展示，如图4所示.KEGG通路富集分析得到74条信号通路(P<0.05)，涉及癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路、FoxO信号通路等，如图5所示.

图4 GO功能富集分析结果 图5 KEGG通路富集分析结果

2.5 化合物-靶点-通路-疾病网络

槲皮素治疗IPF的靶点-通路网络如图6所示.右侧蓝色倒三角代表槲皮素与IPF的交集靶点，右侧黄色三角代表基因富集数最多的前20条通路，进一步利用Network Aalyzer插件对该网络进行拓扑分析，结果显示：AKT1、PIK3CG、RELA等靶点和癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等信号通路的degree值较高，分别为19、18、13、19、17、13，说明上述靶点和通路在该生物网络中具有重要作用.因此，可认为槲皮素可能通过作用于AKT1、PIK3CG、RELA等靶点，介导癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等对IPF产生生物学效应.

图6 槲皮素治疗IPF的化合物-靶点-通路-疾病网络图

2.6 分子对接结果

为进一步研究槲皮素与关键靶点间的相互作用关系，利用AutoDock Vina软件进行分子对接，对接结果如表4、图7所示.一般认为对接分数小于-7.0表明活性成分与靶点具有强烈的结合活性，小于-5.0表明两者有较好的结合活性，小于-4.25表明有一定的结合活性[19].

表4 槲皮素与关键靶点分子对接结果

图7 槲皮素degree值最高的前3个靶点的分子对接图

3 讨论

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)是一种原因不明的以慢性、进行性肺间质纤维化为主要特征的肺系疾病，其发病机制复杂，可能与炎症反应、肺组织的不均匀受累、转化生长因子-β(TGF-β)的激活，上皮细胞间质转化(EMT)等有关[20].槲皮素是多种中药中可被人体吸收代谢的有效成分之一，具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗血栓、抗病毒、心血管保护、免疫调节等多种药理学活性[21],近年来诸多学者对槲皮素抗肺纤维化的生物学效应进行较为深入的研究，药理研究表明槲皮素能够通过调控Smad7信号来实现缓解TGF-β诱导的小鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞NIH3T3纤维化[22]，此外，槲皮素能有效抑制实验大鼠的肺纤维化进展，同时有效促进肺组织的自我修复[23]，但其作用靶点及通路尚不完全明确，因此，本研究利用网络药理学方法构建槲皮素-IPF-共同靶点PPI网络等，系统分析槲皮素治疗IPF的作用机制.

通过OMIM等相关数据库，筛选出槲皮素及IPF相关基因，取交集后共得出槲皮素与IPF共同靶点105个，占槲皮素预测相关基因的56.76%，表明槲皮素可有效作用于IPF，发挥其生物学效应，进一步通过化合物-靶点-通路-疾病网络拓扑分析，发现槲皮素通过AKT1、PIK3CG、RELA等靶基因介导癌症信号通路、PI3K-Akt信号通路、Ras信号通路等发挥治疗IPF的作用.

AKT1是丝氨酸/苏氨酸激酶(AKT)家族中的一个亚型，其通过促使下游底物的磷酸化来参与细胞生长、代谢、增值、凋亡等重要细胞生物学过程[24].AKT1可通过mTOR蛋白磷酸化而激活，并促进相关蛋白表达，进而促进基因转录和蛋白质合成，在纤维化过程中具有重要作用[25].研究表明，通过抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路表达，可提高肺组织细胞自噬活性，缓解肺纤维化进程[26].研究证实，槲皮素可以通过抑制PI3K/Akt信号通路，从而抑制人胚肺成纤维细胞地增值[27].此外，在肺纤维化早期通过抑制p-AKT表达，可以起到抗肺纤维化的作用[28].Ras是PTKs介导的信号通路中的关键蛋白.上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是肺肌成纤维细胞形成的重要过程.大量研究表明，Ras/ ERK1/2信号通路在肺纤维化中具有重要作用.成纤维细胞生长因子2(fibroblast growth factor 2,FGF2)可通过刺激Ras/ERK1/2的激活，负调控TGF-β1诱导的EMT来抑制肺纤维化[29].目前认为IPF是引发肺癌的高危因素，会增加患肺癌的风险，因此涉及多个癌症信号通路，可能与异常成纤维细胞增殖、表观遗传和遗传变化、细胞间通讯减少等有关.RELA是核转录因子-kB(NF-kB)家族中的成员之一，是一种广泛存在于真核生物内的转录因子，NF-kB通路在细胞增殖、存活、早期病毒应答及细胞因子分泌、促炎等多方面具有重要作用[30].研究证实槲皮素能够抑制NF-kB通路，从而减少大鼠炎症细胞及TNF-α等的释放，达到缓解肺纤维化进展的目的[31].PIK3CG是IB型磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的亚型，主要在免疫细胞与内皮细胞中表达，参与免疫应答[32].PI3K/AKT信号通路可以调节下游与炎症反应密切相关的NF-kB信号的激活[33].动物实验表明，花椒有效成分可下调PIK3CG和p-NF-kB的表达，从而减轻小鼠足爪组织中的炎症反应[34].IPF的具体机制目前尚不明确，目前认为自身免疫功能异常与炎症反应是导致IPF发病的重要因素，而PIK3CG有参与机体免疫应答、调节炎症反应的作用.因此，我们预测槲皮素可调控RELA、PIK3CG基因介导其下游通路发挥生物效应，但仍需进一步实验验证.分子对接结果表明，槲皮素与AKT1、PIK3CG、RELA 等靶点的结合能均小于-5kJ/mol，均可生成氢键，说明其与潜在靶点的结合性较高，因此推测，槲皮素未来可能成为治疗IPF的有效化合物之一，可为新药的研发提供新思路.

本研究通过网络药理学和分子对接技术分析了槲皮素在治疗IPF中的分子生物学机制，得出了槲皮素治疗IPF的潜在靶点，涉及的分子功能、生物过程及作用通路，为中医药治疗IPF提供了新的研究思路.虽然本研究所提及的一些通路已被证实有效，但由研究结果可知，槲皮素可通过多靶点介导多通路发挥治疗作用，因此仍值得进一步研究.运用网络药理学发现的其他未被验证的靶点及通路有待进一步研究证实.目前网络药理学研究所涉及的数据库存在数据不全、更新速度慢等不足，对研究结果存在一定影响，因此，后期将结合具体的实验研究验证上述预测结果，为槲皮素治疗IPF提供更科学的理论和实验依据.