黄芩苷治疗非酒精性脂肪性肝病研究进展

孙 中，袁曼玲，刘 帅，彭 冲，王 媛，王艳梅，艾 江

(1.牡丹江医学院研究生院；2.牡丹江医学院附属红旗医院消化内科，黑龙江 牡丹江 157011；3.厦门市妇幼保健院，福建 厦门 361001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一种与基因、环境、代谢、应激等多因素相关的临床病理综合征，也是代谢综合征(Metabolic Syndrome)的肝脏表现。世界范围内，NAFLD 的发病率为9%～36%，在美国等发达国家，NAFLD 的发病率近5年内由15%上升至25%，且常与代谢性共病相关[1]。据报道，非酒精性脂肪肝在我国的发病率在15%～30%，并且呈患病率逐年增高、低龄化的趋势[2]。随着肥胖和糖尿病的发病率增加，NAFLD现已成为我国常见的慢性肝病之一,严重危害人民健康。黄芩苷(Baicalin, BA)是唇形科植物黄芩干燥根中含量最高的黄酮类化合物之一。黄芩在我国药用历史悠久,《神农本草经》中介绍其具有“诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”功效。传统医学中主要用于治疗湿温、暑湿、胸闷呕恶、湿热痞满、泻痢、黄疸、肺热咳嗽、高热烦渴、血热吐衄、痈肿疮毒、胎动不安。现代药理学研究发现，黄芩苷具有抗炎、抗氧化以及抗脂质沉积、抗纤维化的作用。多项研究表明，肝细胞在脂肪变性基础上进一步诱发炎性反应、氧化应激反应是NAFLD进展为肝纤维化、肝硬化发展的关键环节。近年来，越来越多的学者开始关注黄芩苷对 NAFLD 的治疗作用。目前，部分细胞与动物的相关研究证实了黄芩苷治疗 NAFLD取得显著疗效，但临床研究证据不足，缺少临床对照实验研究。本文通过查阅近几年相关文献报道，围绕黄芩苷在NAFLD疾病模型中的相关作用机制研究进展进行概述。

1 脂质代谢

肝脏参与脂质代谢的多个重要环节，包括脂肪酸的摄取与合成,脂质的加工、贮存、氧化分解及输出等。NAFLD主要以肝细胞的脂肪变性和脂肪贮积为病理特征。“多重打击”学说认为，脂肪细胞中游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)水平升高及FFAs 氧化水平降低，进而会引起肝细胞中脂肪过度积累，这是导致NAFLD形成的重要原因。BA是一种多酚类化合物，是从黄芩的根中分离出来的主要生物活性黄酮类化合物，被广泛应用于中医治疗炎症、高血压、心血管疾病以及细菌和病毒感染。多项研究表明，黄芩提取物可显著降低高脂饮食大鼠血浆总胆固醇和甘油三酯水平,BA还能降低人血浆甘油三酯水平，抑制脂代谢异常疾病进展。BA降低高脂饲料(High Fat Diet，HFD)喂养大鼠血脂的机制可能与腺苷酸活化蛋白激酶(Amp-Activated Protein Kinase，AMPK)通路相关。AMPK是细胞和系统水平上脂质代谢的重要调节因子，肝脏AMPK功能障碍是遗传性肥胖啮齿动物、HFD的小鼠和大鼠中肝脏脂质积聚和高脂血症伴肝脏脂肪变性的关键机制。研究观察发现，在肝脏中表达构成活性(CA)-AMPKα1的转基因小鼠的白色脂肪水平降低，并且对高脂肪饮食诱导的肥胖具有抵抗能力。AMPK激活剂二甲双胍和噻唑烷二酮类已被证明能降低肝脏脂肪，改善脂肪肝疾病。

在使用BA干预的对照实验中，研究者观察到其可明显降低HFD大鼠的体重、血浆中胆固醇的含量、自由脂肪酸的含量以及胰岛素浓度，并能够显著降低肝脏脂肪沉积。Gao等[3]观察了BA对HFD大鼠肝脏AMPK活化的影响，实验通过磷酸化抗体免疫blots检测AMPKα及其下游主要靶点乙酰辅酶a羧化酶(ACC)的磷酸化状态来评估AMPK的激活情况，研究发现HFD抑制肝脏AMPKα磷酸化(激活)和ACC磷酸化，而BA可显著恢复HFD抑制肝脏中AMPKα和ACC磷酸化水平，同时抑制肝脏SREBP-1c及其靶蛋白FAS mRNA基因表达，减少脂肪合成酶的表达降低脂肪生成。AMPK在调节能量代谢中主要受两种上游激酶LKB1或Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶β(CaMKKβ)控制。Ying等[4]研究发现，在细胞中黄芩苷通过αthr172磷酸化及其下游靶点乙酰辅酶a羧化酶Ser-79位点磷酸化激活AMPK，使用抑制剂抑制CaMKKβ后，BA处理不再减少油酸引起的细胞内脂质积累。这一结果表明，黄芩苷可能通过CaMKKβ通路激活AMPK。此外，Dai等[5]通过定量化学蛋白质组学分析，发现黄芩苷是一种天然的肉碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1,CPT1)的变构激活剂，黄酮类化合物具有选择性地直接激活肝脏CPT1，加速脂质进入线粒体氧化，改善饮食诱导的肥胖和肝脂肪变性及其他代谢紊乱，破坏CPT1上黄芩苷的预测结合位点，完全消除了黄酮类的有益作用。这一发现可能为肥胖和肝脂肪变性及其相关疾病治疗找到了新的研究方向。

2 炎症反应及相关信号通路调节

体内过量的FFA会从脂肪组织输送到肝脏并储存在肝内池，脂肪堆积会引起肝脂肪毒性，诱导肝细胞释放大量促炎细胞因子，引发氧化应激和肝星状细胞活化，最终导致肝炎性损伤。NAFLD相关炎症的发生涉及各种免疫细胞、信号通路的相互作用，是一个复杂的过程。研究发现，中性粒细胞(neutrophils)和巨噬细胞(macrophages)与 NAFLD的发病机制有关。巨噬细胞和中性粒细胞均能释放炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6等，加重肝细胞的损伤和坏死。TNF-α是一种参与肥胖、IR、高脂血脂及 NAFLD等代谢性疾病的重要的细胞因子，是肝脏损伤过程中最早出现的细胞因子，并且TNF-α能引起 IL-1β、IL-6 的释放，三者一起介导炎症反应，形成级联放大反应。在大鼠肝脏急性损伤模型研究中发现，BA能够减少肝脏组织中的TNFα，NF-κB等的水平以及血浆中的TNFα、IFNγ，IL-6的水平，减轻肝脏炎症损伤。袁颖琳[6]通过对多种炎症介质 mRNAB 表达水平进行检测发现，BA可以不同程度降低NAFLD 肝脏中细胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)、粘附分子(ICAM、ECAM、ELAM)和趋化因子(CCL2、CXCL2)的 mRNA表达。Zhang等[7]发现BA可明显使血清TNF-α，IL-1β和MCP-1产生减少，巨噬细胞流入和核因子-κB激活抑制，从而抑制蛋氨酸胆碱缺乏饮食诱导的肝炎症状。

肝细胞中脂质的积累损伤肝细胞产生脂毒性可激活Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)，TLR4 介导的多条信号通路在NAFLD诱导的炎症反应中起着关键的作用。TLR4被激活后，MyD88 被募集增多，进一步诱导细胞核-κB(Nuclearfactor-κB，NF-κB)和丝裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)的激活转录，促进 TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎性因子的表达和炎症细胞的浸润，加重肝损伤。Kiziltas等[8]在研究中证实，NAFLD 患者和动物模型中TLR4 表达均不同程度上调。Csak 等[9]发现和正常小鼠相比，TLR4 敲除可以减轻胆碱缺乏饲料(Methionine and Cystine deficient Diet,MCD)诱导小鼠的脂肪变性和纤维化。Jin等[10]使用黄芩苷和黄芩苷纳米脂质体干预可明显降低MCD诱导的NAFLD小鼠血浆转氨酶、肝细胞凋亡、肝脏脂质积累、肝纤维化、中性粒细胞和巨噬细胞浸润，进一步分析发现BA通过抑制MCD小鼠toll样受体4(TLR4)信号上调和炎症介质的产生发挥作用。

3 氧化应激

体内活性物质产生增多和抗氧化应激防御的减弱，是NAFLD发生的重要原因。脂质代谢紊乱影响活性氧(Reactive Oxygen Species，ROS)的产生，特别是脂肪酸氧化可能在NAFLD中产生更多的ROS。相关研究表明，抗氧化因子(如辅酶泛醌、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽等)的减少与脂肪性肝病的严重程度呈正相关。

黄酮是存在于自然界的天然抗氧化剂，其可通过多种途径发挥抗氧化能力。分子研究表明黄芩苷可显着降低诱导型一氧化氮合酶(Inducible Nitric Oxide Synthase,iNOS)和环氧化酶2(Cyclooxygenase-2,COX-2)的mRNA表达[11],降低细胞色素C的活性减少活性氧类物质产生，同时激活mRNA和提高蛋白质水平来增强Nrf2介导的抗氧化系统，增加共激活因子-1α，HO-1，GST和NQO1表达，从而改善了NAFLD病情。在NASH大鼠模型中发现，BA 还能通过减轻氧化应激反应来改善有毒物质引起的肝脏细胞肿胀、白细胞浸润以及肝细胞坏死，并且能够降低有毒物质引起的血浆ALT、LDH的上升，提高谷胱甘肽的水平，增加GSH、SOD 酶的活性，减少TNFα、IL-1β、IL-6炎性因子的产生，发挥其抗炎作用。Ai 等[12]发现黄芩苷可以减少氧化应激情况下脂肪酸结合蛋白的形成，增强 L-FABP 的表达以及相关抗氧化酶SOD、GSH等的表达，并能够保护肝细胞免于受到氧化应激的攻击。

4 抑制肝纤维过程

NAFLD在脂肪性肝炎阶段，除有气球样变、点灶状坏死等炎性改变外，已经有明显肝纤维化改变。肝纤维化是炎症及氧化应激损伤后，肝脏产生的纤维结缔组织沉积的一种自身的修复反应，表现为细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)增多,Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原过度增生沉积的结果，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化、横向分化为肌纤维细胞被认为是肝纤维化发生发展的中心环节。HSC 诱导激活、趋化和增殖，促纤维化细胞因子分泌及胶原合成增加，致使ECM 增生与降解失衡，引起肝内纤维结缔组织异常沉积，最终导致肝脏结构破坏、纤维化病变和肝功能异常。体外实验证实BA具有抑制大鼠 HSC活化增殖，促进 HSCs 凋亡，抑制 HSCs 的Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白表达的作用。研究发现，BA能够抑制大鼠NASH动物模型组中TGF-β1、Col1A1产生和抑制a-SMA、I型胶原的表达，此外，BA可增加miR-3595的表达，负调控长链脂肪酸CoA连接酶4(ACSL4)，ACSL4以BA剂量依赖性的方式发挥抗纤维化作用。有研究表明，亮氨酸减少能够诱导敲除基因Gcn2的小鼠产生脂肪肝[13],黄芩苷能回调甲基丙二酸，显著提高左旋亮氨酸含量而参与亮氨酸代谢，改善肝纤维化[14]。这些研究表明 BA可以减轻NAFLD的炎症和纤维化状态。

5 肠道菌群

肠道菌群失调在人类肝病发病中起着重要作用，尤其是NAFLD及其相关的代谢紊乱。肠道菌群相关代谢物可通过肠-肝轴转运到肝脏，有害细菌及其代谢产物进入血液循环可造成菌血症或其他组织的损伤。研究发现，50%非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)病人出现小肠细菌过度生长,晚期肝纤维化患者粪便中变形杆菌水平较高，而早期肝纤维化患者的厚壁菌门水平较高[15],Le Roy等[16]将高脂饮食诱导的 NAFLD 小鼠的肠道菌群移植入无菌小鼠体内，发现无菌小鼠发生 NAFLD。Turnbaugh等[17]发现脂肪肝小鼠中肠道微生物碳水化合物代谢基因富集，导致盲肠短链脂肪酸浓度升高，粪便中能量降低，肝的能量负荷增加。肠道菌群改变可能通过增加肠道能量摄取，减少能量丢失来促进NAFLD的发生。

近年来研究者发现，BA能通过调节肠道革兰氏阴性菌与阳性菌的比例，减少内毒素的生成入血以及炎性因子的分泌，从而减轻代谢性炎症，对NAFLD起到治疗作用[18]。此外，黄芩提取物增加大肠中总厌氧菌及乳酸菌的丰度，并促进丁酸盐的产生[19]，BA能够稳定肠道群落结构,使益菌数量增多,条件致病菌肠球菌数量略减[20]。

6 总结和展望

上述大量与脂质蓄积、脂代谢异常相关的动物、细胞模型的研究证据表明，BA确有调脂、抗炎、抗氧化、抗纤维化、降低肝细胞凋亡、调节肠道菌群等功能。但由于目前BA及相关药物应用于临床研究资料较少，其对NAFLD 患者疗效的临床疗效缺乏实验证据。伴随NAFLD患者日益增多，在天然药物中寻找安全有效的降脂、抗炎、抗氧化新型药物具有重要探索意义。BA具有良好的抗炎、抗氧化作用，对防治并发症也具有一定疗效，相信随着实验的深入研究和临床的积极应用，BA有望成为 NAFLD 及其相关疾病的潜在治疗药物之一。