单核细胞增生李斯特菌生物学毒理特性及防控方法研究进展

关红阳，王 丹，马 越，孙也婷，王宇滨，赵晓燕，梁 浩

（1.北京市农林科学院蔬菜研究中心，北京市果蔬农产品保鲜与加工重点实验室，农业部蔬菜产后处理重点实验室，北京 100097；2.沈阳农业大学，辽宁 沈阳 110866；3.龙大食品集团有限公司，山东 莱阳 265231）

0 引言

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）属于李斯特菌属。目前，国际上公认的李斯特菌属共有7 个菌种。单核细胞增生李斯特菌是唯一能够引起人类疾病的菌种。单核增生李斯特菌是一种细菌性食源性病原体，与世界各地的散发病例、爆发和食品召回有关。现代的食物系统多样而复杂，食品、加工供应品和原料的全球流动，加上单核细胞增生李斯特菌的持续存在和繁殖能力，促进了受污染产品的跨境传播，往往导致大规模召回。食品召回不仅是一个公共健康问题，还会造成重大的经济损失。与其他食源性疾病相比，单核增生李斯特菌的住院率和致死率较高。由于单核细胞增生李斯特菌具有在冷藏温度下生长和存活的能力，即使少量的细菌也是潜在的食品安全问题。因此，在食品卫生微生物检验中，必须引起人们的高度重视。

1 生物学特性

1.1 形态

单核细胞增生李斯特菌简称单增李斯特菌，为革兰氏阳性菌，属厚壁菌门。其大小约为0.5 μm×1.0 μm ～0.5 μm×2.0 μm，直或稍弯曲状，两端钝圆，呈杆状和球杆状。单增李斯特菌可以在营养丰富的条件下形成荚膜，单增李斯特菌在22～25 ℃的环境中可形成4 根鞭毛，运动较活泼；而在32 ℃条件下仅形成一根鞭毛，运动较缓慢[1]。

1.2 培养特性

单增李斯特菌为需氧或兼性厌氧菌；单增李斯特菌对热的抵抗力较弱，在60 ℃下30 min 或在80 ℃下1 min 即可全部灭活[1]；而该菌对低温有较强的耐受性，能在冷藏条件下生长；其生长范围为1～45 ℃（也有报道在0 ℃能缓慢生长），最适培养温度为35～37 ℃；单增李斯特菌在pH 值中性至弱碱性的条件下生长良好；其对NaCl 的抵抗力较强，在6.5%NaCl 肉汤中可以较好地生长[2]。

单增李斯特菌在不同培养基上的生长形态不同。在普通琼脂平板上，初始菌落很小，半透明，呈露滴状，但随着菌落的增大，变得不透明。在血琼脂平板上，菌落通常也不大，圆润，灰白色，穿刺接种血平板培养一段时间后可形成窄小的β - 溶血环，溶血环的直径约为3 mm。在TSAYE 平板和MMA 平板上，菌落呈蓝色、灰色或蓝灰色。单增李斯特菌在麦康凯琼脂培养基（MAC）、伊红美蓝琼脂培养基（EMB） 和沙门志贺菌属琼脂培养基（SS） 上不生长[1]。

2 流行病学

2.1 污染源

单增李斯特菌是一种无处不在的细菌，能够在环境中存活和生长，并容易定殖在广泛的基质，如土壤、污水、人和动物粪便及多种食物。人类和动物可能会食入单增李斯特菌，并通过口腔- 粪便的途径进行传播。据文献报道，健康人类粪便中单增李斯特菌的携带率为0.65%～16.0%，并且约70%的人可在短期内携带该菌。单增李斯特菌既可以随食品原料进入食品加工厂，也可以由排泄物或灰尘经工作人员带入，附着在食品加工设备上并在加工场所存活，从而污染食品[3]。单增李斯特菌能够附着在各种食品接触表面，如不锈钢和聚苯乙烯。由于单增李斯特菌在食品加工过程中具有抵抗不利条件的能力（如高温和低温、气调，甚至是食品加工环境中的设施），表明其可能在食品加工设施中持续数月甚至数年，在加工和后加工过程中单增李斯特菌可能会持续污染食品。迄今为止，科学研究的重点集中在附着潜力、生物膜形成能力，以及对干燥、酸和热的耐受性、对增加的消毒剂亚致死浓度的耐受性和对致死浓度的耐受性。

2.2 污染情况

单增李斯特菌通常是从加工即食、冷藏肉类和奶制品中发现和分离出来的。许多文献研究表明，在不同种类的市售食品中可检测出单增李斯特菌。在食品中，受污染的肉制品被认为是单增李斯特菌感染的主要来源。尤其是受污染的即食肉制品，因为其无需进一步消毒处理即可食用。梁文革等人[4]对宝鸡市13 类共2 357 份市售食品进行分离和鉴定。共计从200 份食品中检测出单增李斯特菌，检出率为8.49%。结果显示，宝鸡市市售食品单增李斯特菌的污染率从高到低分别为调理肉制品44.44%，冷冻肉糜制品36.36%，凉拌菜20.36%，生畜肉19.04%，生禽肉17.24%，以肉制品和凉拌菜中单增李斯特菌的污染率较高。杨修军等人[5]对吉林省市售食品进行检测，5 093 件11 类食品中共检出单增李斯特菌294 株，总检出率为5.77%。其中，肉与肉制品的单增李斯特菌检出率最高，达到了12.43%。杜伟静等人[6]检测北京市东城区市售食品265 件样品，检出单增李斯特菌17 株，全年检出率为6.42%，污染最严重的是肉与肉制品，检出率为15.56%。刘海霞等人[7]检测云南省1 465 份熟肉制品中的单增李斯特菌，检出率为2.18%。生肉中的单增李斯特菌主要是来源于环境中单增李斯特菌的传播。生肉制品可能在屠宰、包装、运输和分销过程中受到单增李斯特菌的污染。而熟肉制品多数由小作坊生产加工制成，对原材料和成品的加工过程缺乏卫生质量控制，从而导致带菌率和污染率较高。再者由于盛放熟肉的器具多为开放或半开放式，极易造成加工后二次污染。生熟食使用同一个案板，也可能会导致单增李斯特菌的交叉感染，所以要特别注意即食肉制品的卫生安全。奶制品中单增李斯特菌的检出率也较高，Barría C 等人[8]对来自39 家智利奶酪生产商的546 份样本（奶酪样本468 份，牛奶样本78 份） 进行检验，其中来自5 个生产商（12.8%） 的19 种奶酪（4.1%） 中发现了单增李斯特菌。近年来，越来越多的报告显示从市场或餐馆的新鲜农产品（如卷心菜、玉米、胡萝卜、生菜、黄瓜、欧芹和沙拉蔬菜） 中分离出了单增李斯特菌[9]。2008 年，Anderson A S 等人[10]评估了圣保罗市售的512 包即食蔬菜中单增李斯特菌的患病率和数量。3.1%的样品中存在单增李斯特菌污染。Szymczak B 等人[11]研究表明，生长在自然施肥土壤中的5%的欧芹对单增李斯特菌呈阳性反应。Seo Y H等人[12]对韩国首尔的一家百货商店、一家当地超市和一家餐馆的蔬菜进行致病菌检测，总共收集了345份经过最少加工的蔬菜样本。结果显示，0.3%的豆芽样品检测到单增李斯特菌。Uzeh R E 等人[13]测试了许多沙拉类蔬菜（生菜、卷心菜、胡萝卜和黄瓜），其中白菜和生菜样品表现出阳性反应。食品中单增李斯特菌污染情况不容乐观，检出率较高，特别是肉制品、奶制品和新鲜农产品，存在一定程度的安全隐患，对这几类食品的生产、运输和销售环节要加强监管，预防食品安全事件发生。

2.3 致病性

单增李斯特菌在环境中具有较强的生存适应能力，在土壤中过着腐生生物的生活，但当它进入人类或动物细胞时，会转变成具有致病性的生物[14]。自从20 世纪20 年代，人类和动物李氏杆菌病首次被认为是由细菌引起的感染以来，单增李斯特菌与1981 年食源性疾病爆发的联系促进了人们对单增李斯特菌的研究，确定该有机体的普遍存在及其传播方法[15]。人类感染单增李斯特菌主要通过接触被感染的动物，也可能由于误食被污染的食品。食品的污染可能发生在食物链的不同环节，从生产、加工到包装和分销，从而引发食品变质，改变最初食品的品质，使消费者不满意，甚至危及生命。此外，单增李斯特菌也可以通过人类的眼睛及破损的皮肤黏膜进入人体而造成感染。单增李斯特菌可导致2 种类型的疾病症状。其中，一种为侵袭性李氏杆菌病，该菌通常会感染身体的无菌部位，如肝脏、脾脏、脑脊髓液和血液[16]。人类感染单增李斯特菌后是否发病，主要与菌的毒力有关，也与宿主的年龄、免疫状态相联系。因此，高危人群为孕妇、新生儿及老年人，免疫功能低下者也易被单增李斯特菌感染。对于孕妇，主要症状是发烧、腹泻、流产或死产，约17%的李氏杆菌病病例发生在孕妇中[17]。而新生儿感染单增李斯特菌可引起肺炎、脑膜炎和败血症[18]。而在免疫能力强的健康成人中，感染单增李斯特菌的主要症状为腹泻和发烧[19]。单增李斯特菌也能引起非侵袭性疾病，通常为热性胃肠炎或非侵袭性胃肠炎，与由受污染的熟食肉类、巧克力牛奶、奶酪、熏鱼和玉米引起的爆发有关。由单增李斯特菌引起感染的李氏杆菌病死亡率极高，可达20%～30%。2010 年，德克萨斯州卫生服务部（DSHS） 报告了一起与切碎的芹菜有关的李氏杆菌病爆发，10 名年龄在56～93 岁的感染患者中，有5 名患者在3 个月内死亡[20]。2011 年，美国多州爆发李氏杆菌病，多人食入了单增李斯特菌污染的哈密瓜，共有147 人感染，导致33 人死亡，1 人流产[21]。同年，美国19 个州爆发了一次与生菜相关的疫情。在这次疫情中，84 人患病，其中15 人死亡。2014 年，加州爆发了一场与苹果污染有关的单增李斯特菌疫情。总共有35 人，包括11 名孕妇，其中7 人死亡[22]。

3 主要毒力因子

单增李斯特菌为侵袭性胞内寄生菌，可穿越宿主三道紧密的屏障（肠屏障、血脑屏障和胎盘屏障）[23]。单增李斯特菌在毒力因子的作用下进入宿主细胞，然后通过血液循环和淋巴循环系统到达宿主的各组织器官，最终引起全身感染[24]。其感染过程包括细菌内化、逃避液泡、细胞吞噬、肌动纤维聚集和细胞间传播等阶段[25]。单增李斯特菌感染宿主过程中的每一步都需要由特定的毒力因子调控[26]。毒力因子的编码基因常聚类于毒力岛。单增李斯特菌主要有2 个毒力岛，分别为毒力岛1（LIP-1） 和毒力岛2（LIP-2）[27]。毒力岛1（LIP-1） 与单增李斯特菌的胞内感染有关，由6 个主要毒力因子的编码基因组成，包括prfA、plcA、plcB、hly、actA、mpl。毒力岛2（LIP-2） 与单增李斯特菌的黏附和侵袭有关。位于该毒力岛上的基因是单增李斯特菌所特有的一个多基因家族，包括inlA、inlB、inlC、inlC2、inlD、inlE、inlF、inlG、inlH。这些毒力基因编码的与单增李斯特菌黏附、侵染相关的主要毒力因子包括InlA、InlB、LLO、ActA 和p60 等[28]。

3.1 InlA 和InlB

内化素是inl 编码的内化素家族的一组蛋白质，内化蛋白是一种参与进入上皮细胞的LPXTG 蛋白，其特征是富含亮氨酸的重复序列（LRRs）。内化蛋白在肠屏障的穿越中起关键作用，包括InlA、InlB、InlC、InlC2、InlD、InlE、InlF、InlG、InlH。内化蛋白A（InlA） 和内化蛋白B（InlB） 是仅在单增生斯特菌中发现的2 种主要表面蛋白，也是最早确定的介导细菌侵入宿主细胞的毒力因子，受转录调控因子PrfA 调节[24]。最近研究表明，InlA 的转录还受Sigma 因子调节，进而影响单增李斯特菌对宿主细胞的侵袭力和致病性[29]。InlA 和InlB 诱导非吞噬哺乳动物细胞的吞噬作用。InlA 为单增李斯特菌穿越肠道上皮和胎盘屏障所必需的因子，由800 个氨基酸组成，其氨基端具有亮氨酸重复（LRR） 区域，中间重复区（IR） 和B 重复区，LRR 与IR 区域是单增李斯特菌入侵人上皮细胞所必需的[24]。InlA 羧基端具有Leu-Pro-X-Thr-Gly(LPXTG)基元，该基元以共价键的方式连接肽聚糖，在单增李斯特菌穿越肠道屏障中发挥重要作用[28]。InlA 在临床菌株中的表达率（96%） 远高于从食品中分离的菌株（65%），表明InlA 对于人类李氏杆菌病的发病机理是至关重要的，因此可以作为食品安全评估项目中毒性的标志。InlB是一种既作为生长因子又作为侵袭因子的GW 蛋白。InlB 由630 个氨基酸组成，是内化素家族的另一成员，与InlA 位于相同的操纵子上。InlB 参与李斯特菌进入广泛的细胞系，包括肝细胞和非上皮细胞。

其氨基端结构域呈信号序列，依次是7 个亮氨酸重复（LRR） 区域，1 个中间重复区（IR），1 个B 重复区。羧基端结构域为3 个串联重复序列。InlB 的氨基端和羧基端结构域在细胞侵袭过程中起协同作用。还有研究表明，InlA 和InlB 在单增李斯特菌黏附在玻璃表面的过程中起重要作用。

3.2 李斯特菌溶血素O（LLO）

李斯特菌溶血素O（Listeriolysion O，LLO） 由毒力基因hly 编码形成。LLO 作为一种孔形成毒素，可溶解大多数哺乳动物的红细胞。LLO 通过溶解细胞并吞噬细胞膜使李斯特菌离开吞噬体，促进菌体进入细胞液，从而在机体内进行增殖，由此被认为是李斯特菌的主要致病因子[30]。LLO 的缺失型突变体无法进入宿主细胞质中，对宿主无毒力，导致细菌毒力的全部丧失[25]。LLO 是一个多功能毒力因子，在LLO 刺激下已经检测到许多细胞反应：细胞增殖、黏膜细胞外渗作用、巨噬细胞中白细胞介素-1 的分泌、宫颈癌细胞中有丝分裂原活化蛋白激酶的活化，细胞黏附因子在感染的内皮细胞上的表达。

3.3 ActA

ActA 是肌动蛋白聚集因子，由毒力基因ActA 编码合成。单增李斯特菌借助细菌表面蛋白ActA 聚集宿主肌动蛋白丝实现在宿主细胞的细胞质内运动。ActA 使肌动蛋白聚合，从而促进其胞内运动和细胞间扩散，对细菌聚集和生物膜的形成至关重要，ActA 可跨越细菌膜和肽聚糖细胞壁。ActA 参与单增李斯特菌的细胞黏附和侵袭过程，也与单增李斯特菌被宿主细胞内化有关[25]。单增李斯特菌能够在细胞内选择性地增加基因的表达，如在哺乳动物细胞的细胞质中ActA 的表达量能够增加226 倍以上，而hly 只能增加20 倍。ActA 缺失型突变体由于硫酸乙酰肝素识别功能的改变，使其在中国仓鼠卵巢上皮细胞和IC-21 鼠巨噬细胞的黏附和侵袭方面受损严重[28]。

3.4 p60

单增李斯特菌的主要胞外蛋白p60 是一种能够水解细菌细胞壁肽聚糖的自溶素，由iap 基因编码形成，是单增李斯特菌致病所必需的。p60 包含一个经典的氨基末端信号序列，其后是功能相关性尚不明确的SH3 区，p60 的中心部分为苏氨酸- 天冬酰胺重复区。羧基末端为一个细胞壁水解酶活性区[24]，p60 参与单增李斯特菌侵袭吞噬细胞的过程，是单增李斯特菌在细胞分裂过程中所必需具备的。由于ActA 在Δp60 突变菌株中的分布不均匀，导致了肌动蛋白尾形成的缺陷，细胞内运动和细胞间扩散急剧减少。尽管与野生型菌株相比，这种Δp60 突变体菌株在小鼠成纤维细胞和人上皮细胞中的侵袭性仅略微减弱，但在小鼠中却显著降低[31]。

4 控制方法

4.1 辐照技术

辐照是一种非热技术，是指应用小剂量的电离辐射对食品表面进行杀虫、灭菌，可作为一种净化技术，以提高食品的安全性和延长食品的保质期。紫外光、γ、X 和α 射线及电子束是工业中最常用的辐照技术。辐照在食品工业中的应用非常广泛，最常见的应用包括抑制发芽、消灭昆虫和寄生虫、杀灭非孢子形成的病原体。辐照技术不仅操作方便，不会造成化学物质残留，并且能较好地保持食品的原有风味，从而达到延长货架期的目的。辐照灭活细菌的机制主要是通过破坏细菌的脱氧核糖核酸来防止细菌繁殖。辐照技术在许多研究中得到了较好的结果。王少丹等人[32]研究了不同剂量的电子束处理及电子束分别与酸化亚氯酸钠（ASC）、柠檬酸（C）的联合处理对鲜切青椒表面食源性致病菌的杀灭效果。结果表明，酸化亚氯酸钠（ASC） 结合1 kGy 辐照处理在不影响鲜切青椒品质的同时，能够有效地杀灭鲜切青椒表面的单增李斯特菌。付萍等人[33]对真空包装的烤鸭、烧鸡和熟肉制品进行了杀灭单增李斯特菌的辐照研究，结果显示2.5 kGy60CO-γ 射线辐照处理可有效地杀灭全部样品中的单增李斯特菌。辐照处理能够有效提高食品的食用安全性，杀灭食品表面致病菌，降低食源性疾病发生的风险。

4.2 化学抑制剂

二氧化氯（ClO2） 是一种应用在果蔬加工生产中高效的果蔬化学杀菌剂和食品保鲜剂。ClO2处理后无残留毒性且成本低，不会影响果蔬品质。ClO2可以防止乙烯的生成，杀灭果蔬表面的致病菌，从而达到长期保鲜的目的，延长果蔬的货架期。气体ClO2对苹果表面致病菌有较好的杀灭效果。在25 ℃条件下，气体ClO2的浓度为6 mg/L，杀菌5 min，对单增李斯特菌的杀菌率达到99.99%[34]。D - 色氨酸也是一种细菌生长的抑制剂。Chen Jian等人[35]研究D- 色氨酸对单增李斯特菌嗜冷性生长的影响。结果表明，D- 色氨酸在冷藏温度下显著减弱了单增李斯特菌的生长。

4.3 天然抗菌剂

乳酸菌（LAB） 是一种天然抗菌剂，能够发挥一定的抗菌效果，主要是由于其能够降低pH 值、竞争营养素、产生H2O2及抗菌化合物（如细菌素）。Morandi S 等人[36]研究发现2 种乳酸菌、乳酸和乳酸钠（LASL） 的组合可有效抑制分离自奶酪的单增李斯特菌。Hossain M I 等人[37]研究了从泡菜中分离出的乳酸菌对生菜、不锈钢表面和MBECTM生物膜装置上的单增李斯特菌生物膜的抑制作用。结果显示，不锈钢、生菜、MBECTM生物膜装置上的单增李斯特菌生物膜细胞分别减少2.17 log CFU/cm2，1.62 log CFU/cm2，1.09 log CFU/peg。Allende A 等人[38]用乳酸菌产生的细菌素作为新鲜切割卷心生菜的化学消毒的替代品。与对照相比减少了1.0～1.5 logs 的单增李斯特菌。Ramos B等人[39]对戊糖片球菌DT016 和片球菌素DT016溶液在贮藏期间抑制蔬菜中单增李斯特菌的潜力进行了评价。结果显示，蔬菜中的病原体数量在整个贮藏期间显著降低。之前的文献研究表明含有乳酸乳球菌发酵物的乳酸链球菌素为控制即食食品上的单增李斯特菌提供了一种简单有效的方法[40]。Kang J H 等人[41]研究诺丽果提取物（NFE） 对单增李斯特菌的抑制效果。结果显示，NFE 制剂对单增李斯特菌具有良好的抗菌活性。精油类物质也是天然抗菌剂。丁香精油是典型的精油类抑菌剂，其主要成分为丁香酚，具有较强的杀虫、抑菌和防腐保鲜作用。0.05%的丁香精油在8 h 内能清除99.99%的单增李斯特菌[42]。牛至精油和柠檬酸单独使用或组合使用均可显著减少灭活单增李斯特菌的时间，从而达到较好的效果。通过添加天然抗菌剂可以提高真空烹调鱼的安全性[43]。已有文献表明，气态柑橘叶精油和麝香草酚等精油类物质对单增李斯特菌具有抑制作用[44]。

4.4 复合抑制剂

越来越多的文献研究了复合抑菌剂对单增李斯特菌的抑菌作用。潘利华等人[45]研究Nisin、ε - 聚赖氨酸、曲酸三种抑菌剂的联合使用对单增李斯特菌的抑制效果，当三者质量浓度分别为184.6 μg/mL，20.5 μg/mL，4.37 mg/mL 时对单增李斯特菌的抑制作用最佳。姜晨等人[46]研究复配抑菌剂对三文鱼中单增李斯特菌的抑制效果。结果表明，甘氨酸、乙酸钠、溶菌酶的质量浓度分别为6.4，4.9，0.6 g/L 的复合保鲜剂的抑菌效果最佳，抑菌率为80.00%±0.23%。

4.5 气调包装

气 调 包 装 （Modified atmosphere packaging，MAP） 是指用在食物储存过程中，改变食品周围气体的组成，包括N2、CO2和O2，可以减少食品生理变化、延缓食品的氧化反应速度、抑制微生物的生长，从而达到延长产品货架期的目的。气调包装对不同蔬菜中单增李斯特菌的抑制情况不同。使用3%O2+5% CO2进行气调包装，贮藏后发现单增李斯特菌能在黄瓜上较好地生长，而在生菜和甜椒上数量有所下降[47]。气调包装已被广泛并成功地用于与冷藏相结合，以保持安全性并延长鲜切水果和蔬菜的货架期。Carrasco E 等人[48]研究了气调包装在抑制单增李斯特菌时与贮藏温度的协同作用。结果表明，4.65%～6.20% CO2+ 2.1%～4.3% O2气调包装鲜切生菜，分别储存在13 ℃和5 ℃条件下，单增李斯特菌最大生长速率分别为0.019，0.013 log/h，到14 d 时其数量分别为4.85，2.66 CFU/g，在较低温度下可以降低单增李斯特菌的生长速率。气调包装技术具有安全且无污染的特点。适当的气调包装处理可以有效地控制食品上致病菌的生长、保持食品的品质、延长食品的保质期。