缺氧诱导因子-1α参与肝纤维化形成机制研究进展*

刘瑞清 综述，袁小澎 审校

1 肝纤维化

肝纤维化是所有慢性肝病所经历的共同中间途径，在酒精、病毒和遗传性疾病等多种因素作用下，在肝细胞损伤修复的过程中伴随着损伤修复慢性化，导致纤维化的发生。伴随胶原蛋白和细胞外基质(ECM)的沉积[1]，导致肝硬化。肝星状细胞(HSC)的活化在上述过程中起着十分关键的作用[2]。当HSC活化后，除了自身分泌作用外，还发挥调节细胞外基质和调节肝脏生长和修复平衡的作用[3]，成为纤维化进程中的关键细胞。HSC活化受到多种促纤维化介质的调节，在调节这些介质的产生过程中，HIF-1α起着十分重要的作用[4]。

2 HIF-1α

2.1 HIF-1α结构 HIF-1α是缺氧诱导因子-1(HIF-1)的组成部分，α亚基(通常为HIF-1α或HIF-2α)与β亚基(HIF-1β也称为芳基烃受体核转位蛋白)一起组成HIF-1。HIF-1α是HIF-1的调节亚基，是主要的功能亚基，对HIF-1的转录活性起着关键性作用。在常氧条件和没有其他代谢紊乱的情况下，HIF的α亚基被脯氨酰-羟化酶(PHD1，PHD2或PHD3)快速羟基化，进而被蛋白酶体降解。因此，在常氧状态下HIF-1α的含量极低[5]。在缺氧条件下，HIF-1α降解受阻，被运输到细胞核内，在核内聚集，与HIF-1β形成二聚体，进而通过与缺氧反应元件(HRE)结合而促进下游靶基因转录生成多种蛋白质产物，发挥多种生物学功能[6]。

2.2 HIF-1α与肝损伤 研究表明，在使用乙醇、对乙酰氨基酚(APAP)和四氯化碳(CCL4)诱导的肝纤维化模型小鼠，HIF-1α均能被检测到高表达。在APAP诱导的肝损伤模型，HIF-1α缺陷能够使得小鼠在6小时内免受APAP肝毒性作用，并且降低肝组织中性粒细胞积累和血浆白细胞介素-6水平，调节正常T细胞表达和分泌，改善APAP刺激后的炎症反应[7]。在胆管结扎(BDL)肝纤维化小鼠中，相较于对照模型组，HIF-1α缺陷能够使得小鼠肝组织I型胶原(Collagen I)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)mRNA和蛋白质水平减少，血小板衍生生长因子(PGDF)和纤溶酶原激活物抑制物-1 mRNA水平亦明显减少[4]。体外实验表明，缺氧能够激活HIF-1α调节基因的表达，而这些基因可能改变HSC对某些激活剂和趋化因子的敏感性，并调节血管生成和胶原合成重要的基因表达[8]。

3 HIF-1α与肝纤维化相关信号通路

3.1 HIF-1α/TGF-β1与HIF-1α/VEGF信号通路 转化生长因子β1(TGF-β1)是免疫反应、炎症、基质合成、细胞生长、细胞凋亡和分化等许多领域的必需介质，亦是参与肝纤维化过程的主要促纤维化细胞因子。相关研究已经证实，抑制TGF-β1表达和调节TGF-β-Smad信号通路是预防肝纤维化的有效方法[9]。在胚胎中的器官生长和成年人受伤组织的修复过程中，血管将氧气运送到远处的器官，促进血管生长，发挥至关重要的作用。当血管生长不平衡时，则会导致许多疾病的发病[10]。血管内皮生长因子(VEGF)具有促进不同来源内皮细胞分裂、增殖和血管构建的作用, 能促进内皮细胞、单核细胞的迁移，诱导血管生成，在新生血管生成过程中起着十分重要的作用[11]。相关研究表明，两种人正常肝细胞系：QSG-7701和L02细胞，在缺氧培养6小时后，HIF-1α、TGF-β1和VEGF表达表现出增加趋势，并在24小时达到较高水平。当予以序列特异性siRNA对HIF-1α表达进行抑制后，能够显著降低缺氧肝细胞中TGF-β1和VEGF的表达，表明TGF-β1和VEGF可能是HIF-1α的潜在靶基因。此外，在细胞培养基内的TGF-β1和VEGF表达也与细胞内表达趋势相同，并且也在HIF-1α被抑制后表达降低。将培养缺氧肝细胞的上清液添加到HSC细胞培养基中可以增强缺氧诱导的HSC活化，也即表明，在低氧状态下HIF-1α能够诱导VEGF和TGF-β1表达增加，进一步诱导并增强HSC的活化，从而促进肝纤维化的发展[12]。HIF-1α还能协同其他基因增强对VEGF表达的诱导作用。例如，单独转染Osx或HIF-1α可分别使VEGF启动子活性增加3.6倍和3.3倍。当共转染同等量的Osx和HIF-1α时，可协同作用使VEGF启动子活性增强9.3倍[13]；E2F7/8与HIF1能够形成转录复合物以刺激VEGFA启动子活性[14]；缺氧时，HIF-1α和信号转导子和转录激活因子3(STAT3)形成转录复合物，调节HepG2细胞VEGF的表达[15]。因此，研究证据表明，HIF-1α能够与VEGF直接相互作用，即VEGF可能是HIF-1α的直接靶基因。

二甲双胍通过抑制HIF-1α能抑制VEGF的表达，抑制基于HSC的血管生成，抑制纤维化的进展[16, 17]。塞来昔布联合奥曲肽能够通过抑制肝内和肝外血管生成，协同改善诱导大鼠的肝纤维化和门静脉高压，其机制可能与p-ERK-HIF-1a-VEGF信号传导途径失活有关，表明HIF-1α与VEGF的信号通路还受上游信号的调控[18]。因此，针对HIF-1α有抑制作用的药物一方面能够抑制TGF-β1的表达，进而抑制TGF-β1诱导的HSC活化等下游反应；另一方面，能抑制VEGF的表达，抑制血管生成，进而影响肝纤维化形成或进一步发展为肝癌。

3.2 HIF-1α诱导细胞自噬相关通路 细胞自噬是细胞内降解过程，其中溶酶体降解蛋白质、细胞器和入侵的微生物[19]，通常由缺氧或饥饿激活[20]。在缺氧条件下，对LX-2细胞予以siRNA使HIF-1α的表达减少后，能够使与细胞自噬相关蛋白LC3B-II和Beclin-1表达减少。当对LX-2细胞予以脂多糖(LPS)刺激时，能够诱导其自噬活性、HSC活化以及HIF-1α的积累增加，表明除了缺氧条件下，在炎症微环境下细胞自噬和HIF-1α增加也是HSCs活化的重要机制[20]。细胞自噬与HIF-1α的积累相关。因此，抑制HIF-1α的产生或增加HIF-1α的降解能够使细胞自噬过程得到抑制，进而抑制HSC的活化过程。H3K4me3，即组蛋白第三亚基四号赖氨酸的三甲基化，是染色质中组蛋白甲基化修饰的重要标记，参与基因表达的激活。缺氧能够诱导细胞的H3K4me3组蛋白甲基化修饰[21]。当对LX-2细胞予以二氯化钴(CoCl2)诱导后，HIF-1α和H3K4me3逐渐增加，且免疫共沉淀表明缺氧LX-2细胞HIF-1α转录复合物H3K4me3组蛋白发生甲基化修饰，故抑制组蛋白甲基化修饰能够使缺氧诱导的细胞自噬受到抑制，从而抑制HIF-1α通过自噬诱导的HSC活化。此外，CoCl2诱导缺氧导致HIF-1α核转运，抑制组蛋白甲基化修饰可抑制HIF-1α的核转位，表明组蛋白甲基化在HIF-1α核转运中亦起重要作用[22]。甲基硫腺苷能够抑制组蛋白甲基化修饰[23]，从而影响HIF-1α诱导的细胞自噬和HSCs活化，抑制肝纤维化进程，但由于组蛋白甲基化修饰涉及其他基因的调节作用，故抑制此过程的负向作用也有待进一步研究。

4 HIF-1α表达相关信号通路

4.1 HIF-1α/ mTOR通路 雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路调节许多重要细胞过程，在生长和分裂细胞的基础生理学中起到了核心作用[24]。mTOR信号传导对于HSC的激活至关重要，为纤维化肝脏中ECM的关键来源。西罗莫司(雷帕霉素)和依维莫司作为mTOR的抑制剂，可显著降低纤维化率达70%，在CCL4肝纤维化模型大鼠，HIF-1α以及p-mTOR(mTOR的活性形式)表达量明显增高，当予以一种能减轻肝纤维化的中药成分芍药甙干预时，两者表达均明显减少[25]。在低氧条件下，HSCs中的p-mTOR水平显著增加，当予以mTOR抑制剂后，能够降低HIF-1α和VEGF表达，从而抑制HIF-1α和VEGF导致的血管生成及纤维化进展[16]。mTOR抑制剂能够减轻纤维化，并且能够抑制HIF-1α的相关作用机制。因此，通过抑制mTOR/HIF-1α通路抑制肝纤维化进程具有可行性，但由于mTOR涉及较多正常细胞生理过程，当其受到抑制时，是否会有其他严重的不良反应还有待探究。

4.2 HIF-1α/ NF-κB通路 核因子活化B细胞κ轻链增强子(NF-κB)是转录因子家族的总称，是调控HIF-1α转录的重要因子。研究表明，缺氧状态下，HIF被激活，可以进一步促进NF-κB亚基向核的转运，从而导致炎症反应加重，而NF-κB可反馈性调节HIF-1α转录，增加其表达[26]。但研究表明，NF-κB可能具有促纤维化和抗纤维化的双重作用，其抗纤维化的作用可能与抑制Collagen I基因表达有关。因此，在纤维化进程中，NF-κB活化能够促进HIF-1α的积累，同时具有一定的抗纤维化活性[27]，故通过抑制NF-κB活性来抑制HIF-1α的积累可能涉及到促纤维化与抗纤维化的平衡，具有双面性。

4.3 HIF-1α/ERK通路 细胞外调节蛋白激酶(ERK)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，是丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族的成员，为信号转导蛋白，正常定位于胞浆，当激活后转位至胞核，调节转录因子活性，产生细胞效应。ERK家族包括ERK1和ERK2，调节细胞许多重要生理作用。研究表明，在缺氧条件下，ERK1/2信号通路能够提高HIF-1的活性[28]。此外，抑制MAPK磷酸化能够增强HIF-1α泛素化，并抑制HIF-1α易位进入细胞核[29]。研究发现，核HIF-1α蛋白存在于肝硬化患者肝脏的巨噬细胞、肝细胞和成纤维细胞，是巨噬细胞产生促纤维化介质的重要调节因子[30]。肝纤维化大鼠HIF-1α和p-ERK表达升高，予以姜黄素处理后能够使HIF1α和p-ERK表达降低，大鼠纤维化程度减轻，表明HIF-1α可能至少部分通过ERK途径促进肝纤维化[31]。因此，通过抑制ERK通路可能抑制HIF-1α的活性或核转运，对纤维化程度起到一定程度的抑制作用。

5 HIF-1α降解相关信号通路

5.1 HIF-1α/琥珀酸信号通路 柠檬酸循环(CAC)是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，分布在线粒体。研究表明，在缺血再灌注损伤时，柠檬酸循环的中间体琥珀酸的异常积累会作为一种代谢信号诱导活性氧簇(ROS)产生[32]。在关于非酒精性脂肪性肝炎的研究中发现，琥珀酸能够诱导促纤维化因子TGF-β1、α-SMA和IL-1β表达，而上述因子能够进一步诱导活化HSC。当对HIF-1α基因进行敲低处理后，上述因子表达减少；反之，当予以HIF-1α活化剂CoCl2后，上述因子的表达增多，表明HIF-1α是琥珀酸盐诱导炎症和激活HSC这一过程必需的因子[33]。在有氧状态下，HIF-1α能够不断合成，又迅速被PHD降解。因此，PHD受损是HIF-1α积累的主要原因[34]。琥珀酸能够抑制HSC中PHDs活性，使HIF-1α的羟基化受损，保持HIF-1α的稳态进而导致HIF-1α积累。在巨噬细胞中，琥珀酸盐还能通过削弱PHD活性来诱导ROS的发生进而诱导HIF-1α积累[35]。

5.2 HIF-1α与VHL通路 von-Hippel-Lindau蛋白(VHL)是HIF-1α与HIF-2α的重要调节因子，常氧细胞中VHL的失活会导致HIF积累活化，表明VHL是HIF降解所必需的重要因子，VHL蛋白还可调节许多器官与细胞的纤维化过程。在肝组织，肝细胞VHL的条件性失活可导致肝脏炎症和肝脏脂肪变性。人类丙型肝炎、酒精性和胆汁淤积性肝硬化患者肝组织VHL表达受到显著抑制，并同时伴随着HIF-1α和HIF-2α的积累。在动物实验中，VHL过表达可以减轻模型小鼠肝纤维化。当特殊不易降解的活性HIF-1α或HIF-2α存在时，纤维化的改善效果将会减弱，表明VHL调节纤维化的过程依赖HIF-1α和HIF-2α。值得注意的是，在BDL小鼠，单独沉默HIF-1α或HIF-2α可抑制肝纤维化，同时沉默HIF-1α和HIF-2α可进一步减弱纤维化；在CCl4组模型小鼠，单独沉默HIF-2α对减轻肝纤维化的作用更加显著，表明HIF-2α可能在病毒性肝纤维化病变起主导作用[36]。

5.3 HIF-1α/YAP通路 HIF-1α在缺氧条件下的积累可以诱导下游靶基因如VEGF-A和血管生成素-2(Ang-2)的转录和释放，进一步促进未成熟血管生成，阻止血窦和肝细胞之间的营养转运，加重肝细胞损伤[37]。肝窦内皮细胞(LSECs)在包括肝纤维化的慢性肝病的发生和发展中起关键作用[38]。当予以HIF-1α的抑制剂ACF时能够降低LSEC中缺氧诱导的VEGF-A和CD31的表达升高，表明HIF-1α与VEGF和CD31的表达有关。YAP作为致癌基因能够影响细胞增殖、衰老、化学抗性和血管生成。当予以YAP siRNA后，抑制了YAP的表达，同时VEGF-A和CD31的表达降低，予以YAP质粒使其表达增加时则使VEGF-A和CD31的表达增高。两部分结果表明YAP可能通过促进HIF-1α在LSEC中的积累而发挥促血管生成作用。但另有研究表明，YAP的干预不能显著改变HIF-1αmRNA水平，可能由于YAP通过控制蛋白酶体介导的HIF-1α降解过程来影响HIF-1α蛋白的稳定性，但不影响HIF-1α的基因转录[37,39]。YAP/HIF-1α通路与HIF-1α的降解相关，故可考虑研究使相关的蛋白酶体失活或者阻断YAP的相应受体从而减轻HIF-1α的积累，促进其正常降解，进而减轻肝纤维化进程。