冠状病毒感染性疾病尸体检验相关病原学检测回顾与展望

王韵怡，周南，乐嘉诚，张凯，赵乾皓，郑大，胡丙杰，成建定

1.中山大学中山医学院法医学系，广东 广州510080；2.广州医科大学病理学教研室，广东 广州511436

冠状病毒（coronavirus，CoV）是一类广泛存在于自然界、直径80～160 nm、基因组全长27～32 kb、可引起人畜共患病的单股正链RNA 病毒。这类病毒在分类上属套式病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属，有包膜，表面有多形性花冠状突起，包括突起（spike，S）蛋白、膜（membrane，M）蛋白、小膜（envelope，E）蛋白和核衣壳（nucleocapsid，N）蛋白4 种结构蛋白[1]。冠状病毒主要引起呼吸及消化系统疾病，其中严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）冠状病毒、中东呼吸综合征（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS）冠状病毒分别在2003 年和2012 年在全球引起了感染大流行，2019 年年底，SARS-CoV-2 来袭，引发了严重的新型冠状病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情。

冠状病毒传染性较强，重症死亡率较高。冠状病毒感染性疾病在短短17 年之内发生3 次世界大流行，强烈提示此类疾病的防治将是我们未来的一项长期工作，值得高度重视。病原学检测不仅是临床确诊传染性疾病的金标准，也是传染性疾病尸体检验、病原学研究的重要内容。目前，SARS-CoV-2阳性与COVID-19 临床病程的动态变化关系尚未阐明，如病程中的患者病毒核酸检测阴性、康复出院患者核酸检测再次阳性等问题十分突出。在此类传染病死者的尸体检验中开展细致的病原学研究，对于揭示病毒感染人体的途径、靶器官及其时空分布规律，并进一步阐明其致病机制，对指导临床患者的病原学诊断、疗效和康复判断具有十分重要的意义。本文通过系统介绍冠状病毒感染性疾病SARS 和MERS 等尸体检验病例的病原学研究情况，以期为正在流行的COVID-19 及今后可能的冠状病毒感染性疾病尸体解剖的病原学研究提供借鉴和参考。

1 SARS

SARS 又称非典型肺炎，是由SARS-CoV 引起的累及多器官的传染性疾病，主要表现为咳嗽、发热、呼吸困难等呼吸道症状。

1.1 光镜观察

通过常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色或特殊麦氏（Macchiavello）染色法，光镜下即可观察 到 病 毒 包 涵 体[2-3]。LANG 等[4]将3 例SARS 死 亡 患者的肺组织经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm 连续切片，HE 染色，在肺泡上皮内检见病毒包涵体样结构，呈球形、类似红细胞大小、嗜酸性染色、带空晕的均质无结构小体。赖日权等[5]对1 例SARS 死亡患者部分肺组织进行Macchiavello 染色，在肺泡上皮细胞、单核巨噬细胞胞质内检见病毒包涵体。

1.2 透射电镜观察

将尸体检验各部位标本用2.5%戊二醛溶液固定，1%锇酸溶液后固定，梯度脱水，浸透，环氧树脂制剂Epon812 包埋，超薄或半薄切片、定位，可在透射电镜（transmission electron microscope，TEM）下观察是否存在病毒颗粒[6]。赵景民等[7]在1 例SARS 死亡解剖病例组织标本中，观察到肺组织中多数Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞及细小支气管上皮细胞、部分肺泡间隔毛细血管内皮细胞内，淋巴结和脾内部分单核巨噬细胞、淋巴细胞内，以及部分心肌细胞胞质内和肾小管上皮细胞的胞质或扩张的内质网内可查见较多病毒颗粒。

1.3 病毒分离与滴定

由于受到样本储存、切片制备以及观察方法等影响，有时并不能在组织切片中观察到病毒颗粒，必要时可进行病毒分离，具体方法可参考文献[8]。赵景民等[7]在患者鼻咽拭子、含漱液、肾等组织分离到SARSCoV。朱雷等[9]分别采集1 例SARS 死者解剖病例的心、肺、肝、脾等组织，接种细胞后，源于心、肺标本者在第1 代即可分离出病毒，而源于肝、脾标本者则在第2 代分离出病毒，说明心、肺标本病毒含量较肝、脾标本高，进一步证实SARS-CoV 可以感染患者多个主要器官，且对心、肺组织侵害强于肝、脾组织。

1.4 病毒核酸检测

病毒核酸检测是病毒病原学检测中最关键的一种手段，包括全基因组测序和核酸特异性片段检测。病毒RNA 的来源通常是组织标本直接提取物，常用的核酸片段检测方法大致可以分为核酸测序和核酸原位杂交（in situhybridization，ISH），而核酸检测的目标片段一般选择SARS-CoV 基因特异性片段或其RNA 聚合酶基因片段。

1.4.1 SARS-CoV基因特异片段检测

晏辉钧等[10]采用反转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）和巢式PCR 扩增等方式，从3 例SARS 死者的部分肺组织中扩增出了SARS-CoV RNA 的两段cDNA 序列。秦杰[11]则应用病毒RNA 检测盒从一些尸体检验标本的鼻咽吸取物和血浆中提取出病毒RNA。

国际上采纳较多的是检测SARS-CoV 编码N 蛋白和主要抗原S 蛋白的N 区和S 区片段，这些片段高度保守，具有代表性，检出率较高。朱雷等[9]以尸体检验各组织的病变细胞提取的RNA 为模板成功扩增出部分S 区和N 区的cDNA 片段产物。

1.4.2 SARS-CoV RNA聚合酶基因检测

在病毒的复制增殖过程中，RNA 聚合酶起重要作用，其基因具高度保守性，因此还可通过检测其RNA聚合酶基因来检验病毒的存在。洪涛等[12]在SARS 死者肺组织中扩增出CoV RNA 聚合酶基因片段。张庆玲等[13]则对尸体检验组织切片进行原位杂交，检测其中的SARS-CoV 聚合酶RNA 的表达，结果显示，多个部位存在阳性杂交信号，且主要分布于呼吸系统、免疫系统等。另外，尸体检验标本的内分泌器官虽有较强的RNA 表达，但并没有出现明显的病理形态学改变，值得注意。

1.5 病毒相关蛋白检测

抗原是尸体检验中病毒相关蛋白检测的主要对象。免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）是尸体检验中最常用的一种检测手段，对于法医学鉴定具有重要意义。研究者们多使用抗N、S 蛋白的单克隆抗体进行检测，NICHOLLS 等[14]制备了SARS-CoV核蛋白特异性单克隆抗体，对32 例SARS 死亡患者的尸体检验肺组织进行IHC 染色得到阳性信号。贺莉等[15]对4 例SARS 死者的多个器官组织石蜡切片用抗SARS-CoV N 蛋白单克隆抗体进行IHC 染色，结果显示，标本的肺上皮细胞、脾和淋巴结浸润的单核细胞等细胞质内均呈强阳性表达。该团队还利用抗SARS-CoV S 蛋白单克隆抗体成功检测到仅在各器官血管紧张素转化酶2（angiotensin-converting enzyme，ACE2）表达阳性的细胞中存在强阳性信号[16]。许慧等[17]用全病毒抗原免疫，制备了具有更好反应性的抗SARS-CoV 单克隆抗体，并对2 例肺标本切片进行IHC 染色，也得到了阳性结果，镜下有大量棕黄色病毒颗粒。

另外还有多种如胶体金试纸、酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等检测特异性抗体的试剂盒可选用。

2 MERS

MERS 是由MERS-CoV 引起的一种表现为急性肺炎伴发肾功能衰竭的冠状病毒感染性疾病，虽与SARS-CoV 同属冠状病毒，但作用的受体不同，基因上存在明显差异。MERS 病死率较SARS 高，由于发病数量相对较低，且主要集中在中东地区阿拉伯半岛，因解剖条件受限，有报道的尸体检验病例数较少。

2.1 病毒核酸检测

病毒核酸特异性片段的扩增方法包括多重探针的RT-PCR 和不依赖温度循环的反转录环介导等温扩增（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）检测等，目的基因可包括病毒基因组开放性读码框upE、ORF1a、ORF1b、RdRp和N基因等保守区域[18]。此外，国内外还开发了等温情况下的重组酶辅助扩增（recombinase aided amplification，RAA）技术的RT-RAA[19]和反转录重组酶聚合酶扩增（reverse transcription-recombinase polymerase amplification，RT-RPA）[20]等短时高效的MERS-CoV检测方法。

2.2 病毒相关蛋白检测

YAMAOKA 等[21]制备了抗MERS-CoV N 抗原的单克隆抗体，建立了双抗体夹心的ELISA 和胶体金检测方法。SONG 等[22]利用特异性N 蛋白单抗，制备了针对N 抗原的胶体金快速检测试纸条，都可用于MERS-CoV 抗原的组织切片检测。

除此之外也有多种检测血液中特异性抗体的试剂盒，如间接免疫荧光法的试剂盒等。

3 COVID-19

COVID-19 是由SARS-CoV-2 引起的急性呼吸道传染病。SARS-CoV-2 对人群普遍易感，扩散能力强，发病人数多，其症状可能轻微、甚至无任何临床表现，但重症患者易出现多种并发症导致死亡。从全球目前的疫情看，总体上COVID-19 的病死率可能低于SARS 和MERS。

3.1 TEM观察

已有课题组在TEM 下成功观察到呈球状或椭圆形、包膜完整、表面有规律排列的冠状突起、略呈光晕或花环状、核心呈高电子密度的SARS-CoV-2 病毒颗粒[23]。YAN 等[24]利用冷冻TEM 和结构生物学技术首次成功解析了SARS-CoV-2 表面S 蛋白受体结合域与细胞表面受体ACE2 全长蛋白复合物的三维结构和相互作用方式，证实了冠状病毒的器官分布与人体ACE2 蛋白的分布密切相关，有助于进一步了解病毒入侵人体的机制，并由此提示尸体检验病原学检测的可取材部位。

3.2 病毒的分离

除利用Vero 细胞进行传代培养外，LU 等[25]采用特殊致病性的人气道上皮细胞（human airway epithelial cells，HAE）进行病毒分离，将患者的咽拭子或肺泡灌洗液接种于HAE 细胞，通过经典的科赫法进行病毒的初步鉴定。

3.3 病毒核酸检测

已有报道[26]利用高通量宏基因组二代测序（metagenomic next-generation sequencing，mNGS）的基因组测序技术方法测得SARS-CoV-2 的全基因组完整序列。WANG 等[27]还研发了纳米孔靶向测序（nanopore targeted sequencing，NTS）的创新性技术，阳性检出率较荧光定量RT-PCR 高。多重PCR 扩增子测序能够从病毒载量极低的极端样本中获取全基因组信息，其成本较低，更适用于尸体检验病原学检测。

冠状病毒的快速检测大多是对高度保守的靶标序列ORF1a、ORF1b、N、E基因片段的识别，实时荧光RT-PCR 是目前SARS-CoV-2 检测应用最广泛的一种。有研究[28]结果表明，新鲜尸体组织和经10%甲醛溶液固定的石蜡包埋（formalin fixed paraffin-embedded，FFPE）组织均能通过PCR 检测到SARS-CoV RNA。虽然10%甲醛溶液固定过程会对RNA 产生修饰，限制了RNA 的应用，FFPE 组织被认为不是获得原始RNA 的最佳选择，但可从这些来源中回收可扩增RNA。许三鹏等[29]将COVID-19 术后4 d 死者的肺组织病理石蜡样本进行总RNA 提取，发现石蜡切片中提取的RNA 质量能满足病毒检测要求，能够使用荧光定量PCR 和核酸检测试剂盒进行检测，提示除了痰液、鼻咽拭子、呼吸道抽取物、肺和气管灌洗液、肺活检组织、眼结膜和肛拭子外，还可将石蜡标本作为病毒检测的补充。由于已有证据[28-29]证明，尸体组织和FFPE 切片均可提取到满足核酸检测条件的病毒RNA，因此，可以尝试将临床上病毒核酸检测的方法运用在尸体病原学检测上，如LAMP、高灵敏度的微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）、同时检测同一病毒多种不同亚型的多重RT-PCR、联合探针、基于成簇的规律间隔的短回文重复（clustered regularly interspaced short panlindromic repeats，CRISP）的基因编辑技术CRISPR/CRISPR 相关系统（CRISPRassociated systems，Cas）检测靶向RNA、高通量基因芯片以及切口平移法快速筛查等。

3.4 病毒相关蛋白检测

在法医学尸体检验和鉴定过程中，因法医学领域尚无专业性实验室进行病毒的分离和检验，因此可选择对病毒相关蛋白进行检测。临床上目前基于抗原和抗体检测的即时检验产品中，大多数是以IgG、IgM 为检测目标的试剂盒，可用于法医现场快速筛查检测，而一些单克隆抗体产品则适用于IHC 等抗原检测方法。

3.4.1 病毒抗原检测

检测方法包括IHC、Western 印迹法、ELISA 单克隆抗体夹心、免疫胶体金法、免疫荧光法（immunofluorescence assay，IFA）和高通量化学发光技术等。市面上已经有可用的抗SARS-CoV-2 S、N 蛋白的单克隆抗体，可用于IHC，还有研究将其应用于IFA 并成功检测到细胞中病毒抗原[30]。Western 印迹法是一种通过特异性抗体检测特定抗原的蛋白质检测技术，可用于检测病毒本身表面蛋白的表达或借抗原检测特异性抗体的存在与活性，但操作较复杂，免疫模式较固定，且需内参，否则结果的准确性无法保障。国外有研究[31]利用COVID-19 患者恢复期血清作一抗，识别出转染Vero 细胞总蛋白中SARS-CoV-2 N、S、E 抗原的蛋白条带。免疫色谱试纸条和ELISA 均可对抗原或抗体进行检测，前者简便省时但灵敏度、特异度不高，后者灵敏度、特异度高，方法灵活，但通量小、费时长。化学发光技术同样可用于检测抗原或抗体，其灵敏度、特异度高，但检测设备成本也高。已有高通量化学发光SARS-CoV-2 快速检测商业试剂盒，可同时满足抗原、抗体的检测需求，可考虑应用于法医学实践中的病毒检测。

3.4.2 病毒特异性抗体检测

血清学检测特异性抗体IgG、IgM 的主要方法多为胶体金免疫层析法、磁微粒化学发光法、免疫荧光法和ELISA。LI 等[32]开发的IgM-IgG 联合抗体检测试剂盒在15 min 内即可通过外周血快速筛查COVID-19，灵敏度和特异性分别达88.66%和90.63%。基于以上各方法的单人份快速抗体测试卡，操作简单易观察，有望应用于法医学现场快速检测。另有研究[33]采用ELISA 检测基于重组的SARS-CoV-2 N 蛋白和S 蛋白所构建的重组蛋白的IgM、IgG 抗体，结果显示，基于N 蛋白和S 蛋白的抗体［IgM 和（或）IgG］检测阳性率分别为80.4%和82.2%，且检测阳性率随着患病天数的增加而增加，ELISA 法灵敏度高，尤其适用于患病10 d 后患者血清标本的检测，可作为COVID-19诊断的重要补充方法。

4 尸体检验病原学检测的实践问题

4.1 检测方法的选取

SARS-CoV-2 的病原学检测方法在临床实践中不断发展和更新，但由于尸体检验工作的特殊性，部分检验方法无法在法医学实际工作中应用。尽管如此，传染病尸体检验的病原学检测策略仍能从临床中获得启发与思考。例如：疑似COVID-19 死者的现场勘验或尸体检验前，可尝试利用上海交大谭蔚泓院士团队[34]研发的一种针对SARS-CoV-2 的便携式家庭简易快速检测试剂盒，该试剂盒仅需对深部气管吸液或鼻咽部分泌物进行检测，实现了对病毒的现场、快速检测。另外，仅需滴血的IgG-IgM 联合抗体检测试剂简便快捷、灵敏度高、特异性强，有望开展其在法医学实践中的现场运用。有团队利用SARS-CoV S重组蛋白片段和Western 印迹法，反向检测待测血清中是否存在相应的抗体，并与检测特异性抗体的ELISA 试剂盒进行比较，发现Western 印迹法在ELISA 阴性和部分类似SARS 症状的ELISA 阳性病例中有其鉴别意义[35]。法医学SARS-CoV-2检测也可尝试使用COVID-19 患者恢复期血清作为检测抗体，进行Western 印迹法检测病毒抗原，或开发病毒抗原重组片段对待测血清进行反向检测。对于受死后变化影响较大的样本，也可尝试采用CRISPR/Cas 基因编辑、多重PCR 扩增子测序等所需病毒滴度低、灵敏度高的技术进行检测。

另外，重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification，RPA）技术简单、快速、灵敏，成本低，耗时短，稳定且易于保存[36]，对抑制剂具有很大的耐受性；依赖核酸序列扩增法（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）的检测仪便携、适用范围广，可实时观测结果，对靶RNA 定性、定量，扩增效率和灵敏度也较高[37]，属于高通量检测方法。这两种技术均适于快速检测。而适配体是一种单链寡聚核苷酸，其制备简便、要求低，亲和力强，稳定性更佳，可以替代抗体作为抗原检测的探针[38]，目前已有许多研究应用适配体对病毒蛋白或全病毒进行检测。第三代反义肽核酸（antisense peptide nucleic acid，antisense PNA）是一种人工合成的多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA 类似物，具有更高的杂交稳定性、热稳定性、化学稳定性和生物稳定性，已用于多种病毒的检测，在PCR、荧光原位杂交等领域有较广阔的应用，其过程快速、灵敏、高效、准确、成本低，可检出更多突变信息[39]。这些技术在法医学的应用有待进一步研究，以期探索出适用于法医学病原体检验的方法。

4.2 检测结果的影响因素

死后变化对病原学检测结果有较大的影响。一方面，若死亡时间过长，死后细胞自溶可能造成病毒定位和核酸提取困难，广泛存在的RNA 酶会使不稳定的病毒RNA 大部分降解，导致可获片段过短或过少，无法得到准确的结果；另一方面，机体内蛋白质会在细胞自溶后释放的水解酶和腐败菌的作用下按照一定的规律逐步降解，死亡时间过长，就有可能检测不到特异性抗体或病毒抗原。赖日权等[5]发现，在死后即刻的穿刺组织中，肺泡内单核巨噬细胞、肺泡Ⅱ型上皮细胞及毛细血管内皮细胞的胞浆或扩张内质网内可见清晰的冠状病毒颗粒，而在死后12 h 的肺组织中病毒颗粒结构模糊，辨别较为困难。陈德蕙[40]认为，在尸体组织TEM 样品制备中，固定非常关键，组织一旦离开血液供应，必须立即固定，间隔时间越短越好，否则会发生明显的细胞自溶，在细胞内的各种病原微生物超微结构保存不佳，可能会失去原有形态特征，容易与衣原体混淆。

除了死后变化，死者的病程长短也对检测结果有影响。据有关研究[14]报道，在发病后2 周内死亡的7 名SARS 患者中，有4 名患者的尸体检验样本中出现SARS-CoV N 蛋白阳性染色结果，其中死于出现症状5 d 后的2 例患者病毒感染细胞数量最多，而在发病2 周后死亡的25 例患者中没有检测到定位信号。该结果提示，发病2 周后肺组织细胞中的病毒复制呈下降状态，且发病10～15 d 后从样本中通过RT-PCR 检测到的病毒载量开始减少，可能与特异性抗体的出现有关。因此推断冠状病毒肺炎患者病程在2 周内者，尸体检验时较大可能检测出病毒阳性结果，而病程大于2 周者，由于机体免疫清除、细胞死后自溶等因素的影响，一般较难出现阳性结果。

4.3 尸体检验样本的获取、保护与检测

在尸体检验开始前的现场检测中，对于死亡时间较短的，可利用外周血、口腔拭子或其他分泌物进行快速的病毒筛查，以便预防病毒传播。需注意的是，由于SARS-CoV-2 主要引起下呼吸道感染，取气管、支气管分泌物要优于鼻咽分泌物，亦可尝试取脑脊液作样本。若通过尸体检验进行确诊，则在尸体检验时应以靶器官或病变严重器官（如肺组织）为主要检测样本。若研究病毒在体内的侵袭分布规律，则应广泛获取器官组织（如肾、肠等）。若所取组织块为石蜡切片，则应立即置于4%甲醛溶液或2.5%戊二醛溶液中固定保存。若直接进行病毒核酸分析，组织块应用装有病毒灭活液的保存管保存并立即在2～8 ℃下转运送检，不能立即检测的需4 ℃或冰上短期保存，提取的RNA 样本应储存于-70 ℃。分泌物应使用专用拭子采样后置于含核酸酶抑制剂的病毒保存液中，拭子与体液样本用一次性密封容器封闭其外包装并用75%乙醇溶液消毒，4 ℃保存。标本需给予特殊标识并应在2～4 h 内尽快送检。尸体检验过程中的注意事项及人员防护可参考文献[41-42]。

标本接收后用75%乙醇溶液消毒外包装，检测前建议56 ℃45 min 灭活，死后即刻肺穿刺者可在TEM下直接观察，行组织切片者可进行Macchiavello 染色后光镜观察，或行IHC 染色。石蜡切片和组织块、分泌物、外周血等可进行病毒RNA 提取后利用实时荧光RT-PCR、LAMP 或原位杂交技术检测核酸特异性片段，由于病毒可能发生变异，一般需分别在ORF1a、ORF1b、N基因上选取2 个靶标，或在E基因上选取第三个靶标，也可进行全基因组的高通量测序，如多重PCR 扩增子测序或探针捕获测序。所有实验室检测过程（如RT-PCR 等）应在生物安全防护（BSL）二级以上的实验室的生物安全柜中进行（病毒分离和尸体检验等则需在BSL-3 设施中进行），并注意个人防护。完成检测后应用75%乙醇溶液消毒工作空间并做好个人清洁，剩余的检材和废物应经过高压蒸汽灭菌后按照医疗废物的规定丢弃。

现有病原学检测方法主要服务于临床病原学诊断和研究领域，能够对病毒的存在、滴度以及不同器官时空分布特征进行诊断。通过借鉴临床的病原学检测手段，有望在法医学尸体检验中引入操作简便、诊断快速、结果可靠的技术，或开发敏感性高、更适用于尸体组织、病理切片中病原学检测的方法与技术，以解决尸体检验组织受死后变化等因素限制而导致的RNA 易降解、含量低、取材难的问题。在COVID-19 等冠状病毒感染性疾病的尸体检验中开展系统深入的病原学研究，不仅对法医病理学上病变部位的寻找、疾病的确诊以及最后的死因鉴定都具有重要的实用价值，而且可望阐明此类病毒侵袭、感染、损害人体器官的时空规律，为研究冠状病毒感染性疾病的发病机制和临床防治策略提供科学依据。