长叶紫珠化学成分及抗炎活性研究

赵 璐，徐 凡，易侨祺，张桃莉，王红刚

广东药科大学中药学院，广州 510006

长叶紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)，为马鞭草科紫珠属植物，产于我国台湾、广东、云南，生于海拔1 400 m下的山坡疏林中，在印度尼西亚、菲律宾、马来西亚、越南、缅甸、印度也有分布[1]。长叶紫珠别名老哈眼，在我国福建地区其常被当作民间草药使用，应用历史悠久且有较好的疗效。据《福建民间草药》和《闽南民间草药》记载，长叶紫珠又名山枇杷、牛舌癀，《中国药植图鉴》中又称其为野枇杷，味苦辛，性温，有微毒。具有祛风除湿、活血止血、清痰镇咳、解毒杀虫的功效，常用作治疗风湿痛、吐血、风寒咳嗽、虫证等症。紫珠属植物当中的许多植物在古代民间的常用草药以及各地民族药书籍中都有所记载，该属在国内共46种植物，其中20多种植物的清热、祛风湿、止血等药效效果十分明显，现代研究报道紫珠属植物具有抗炎[2-6]、止血[7]、镇痛[8,9]、抗氧化[10-12]、改善记忆障碍[13,14]等药理作用。

作为一种民间用药，长叶紫珠应用历史悠久、疗效显著，但一直以来有关长叶紫珠的研究报道却很稀少。本文选取紫珠属植物长叶紫珠作为研究对象，在紫珠属植物的研究基础上，以期从长叶紫珠中寻找出具有良好抗炎效果的活性成分，为抗炎药物的开发提供一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

核磁共振仪(AVANCE III 500MHz，瑞士布鲁克拜厄斯宾有限公司)、高分辨质谱(maXis impact，德国Bruker公司)、半制备高效液相色谱仪(北京赛谱锐思科技有限公司)。

硅胶(100～200、200～300目，青岛海洋化工有限公司)；MCI(三菱化学公司)；ODS(日本YMC公司)；Sephadex LH-20(北京赛谱锐思科技有限公司)；石油醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、甲醇(天津市大茂化学试剂厂，分析纯)；甲醇(瑞典欧普森试剂公司，色谱级)；DMEM高糖培养基、胎牛血清、胰蛋白酶(美国Gibco)；磷酸缓冲盐溶液(PBS)(美国Gibco)；二甲基亚砜(美国Mpbio)；CCK8细胞计数试剂盒(美国APExBIO)；地塞米松、脂多糖(LPS)(美国Sigma)；Griess试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)。

长叶紫珠CallicarpalongifoliaLamk.采集于广东药科大学大学城校区中药学院药用植物园，经中国科学院华南植物园叶华谷教授鉴定为马鞭草科紫珠属植物长叶紫珠(CallicarpalongifoliaLamk.)的枝叶。凭证标本(标本号201980723)存放于广东药科大学中药标本馆。

1.2 实验方法

1.2.1 提取与分离

长叶紫珠干燥枝叶5.5 kg，粉碎成粗粉，以甲醇冷浸方式提取5次(前3次冷浸提取48 h，后2次冷浸提取72 h)，每次约20 L，合并甲醇提取液，减压浓缩，回收溶剂后得甲醇浸膏888.65 g。将甲醇浸膏用温水进行分散(浸膏∶水 ≈ 1∶1，V/V)后，分别用石油醚(6×1.2 L)、乙酸乙酯(6×1.2 L)、正丁醇(6×1.2 L)依次萃取，再分别合并有机层并减压浓缩，最终得石油醚浸膏222.15 g，乙酸乙酯浸膏271.02 g，正丁醇浸膏182.12 g。

将乙酸乙酯浸膏(271.02 g)以硅胶为固定相，以二氯甲烷-甲醇(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱检查后合并相同部分，得到16个组分(Y1～Y16)。Y3组分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，以二氯甲烷-甲醇(1∶1，V/V)洗脱，得到13个组分(Y3.1～Y3.13)；Y3.4组分经MCI及数次Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后，得到化合物9(99.2 mg)。Y4组分经Sephadex LH-20凝胶柱分离后，得到5个组分(Y4.1～Y4.5)；Y4.5组分再次经硅胶、MCI柱分离纯化后，得到化合物3(7.0 mg)。Y5组分经硅胶柱层析分离，使用石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1，V/V)以及纯甲醇洗脱，得8个组分(Y5.1～Y5.8)。Y5.3组分经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离后，得到6个组分(Y5.3.1～Y5.3.6)；Y5.3.3组分经半制备高效液相色谱纯化后，得到化合物2(85%甲醇-水，tR=12.032 min，5.0 mg)；Y5.4组分经MCI、Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化后，得化合物4(2.3 mg)。Y7组分经硅胶柱色谱以石油醚-乙酸乙酯(200∶1、100∶1、50∶1、30∶1、15∶1、9∶1、7∶1、5∶1、3∶1、1∶1，V/V)以及纯甲醇洗脱后，得到8个组分(Y7.1～Y7.8)； Y7.3组分经重结晶纯化后得到化合物5(111.9 mg)；Y7.4组分经MCI、凝胶柱色谱，以及半制备高效液相色谱分离纯化后，得到化合物10(80%甲醇-水，tR=15.408 min，3.1 mg)；Y7.6组分经MCI柱色谱分离后得到12个组分(Y7.6.1～Y7.6.12)。其中Y7.7组分经MCI、硅胶和多次凝胶柱色谱分离后，得到化合物1(205.4 mg)和6(5.0 mg)。Y10组分则经重结晶纯化后得到化合物7(92.6 mg)。

正丁醇浸膏(182.12 g)，以MCI为固定相，以甲醇-水(10%→100%)为洗脱剂进行梯度洗脱，经薄层色谱检查，合并相同部分后，得到4个组分Fr.W1～Fr.W4。Fr.W 2组分经半制备液HPLC分离纯化后，得到化合物8(42%甲醇水，tR=17.036 min，25.0 mg)。

1.2.2 抗炎活性研究

用CCK8法测定RAW 264.7细胞在不同浓度化合物环境下的存活率来评价对应化合物的细胞毒性作用。根据细胞毒性测试结果对本实验化合物的给药浓度进行设计。

将处于对数生长期的小鼠巨噬细胞RAW 264.7稀释并接种于96孔板，每孔100 μL，细胞密度4×104个/孔，孔板边缘加入100 μL PBS，培养24 h后进行下一步实验。将不做处理的完全培养基正常培养的细胞作为空白对照，将仅加入100 ng/mL LPS的细胞设为模型组。以100 ng/mL LPS及0.5 μmol/L地塞米松作为阳性组，以不同浓度化合物及100 ng/mL LPS作为实验组。加入药物后，培养18 h。分别取各组细胞上清液用Griess法检测NO释放量水平。

2 实验结果

2.1 结构鉴定

化合物1白色棒状结晶；HR-EI-MS：m/z303.233 0 [M+H]+(calcd for C20H31O2，303.231 9)。1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：2.24(1H，m，H-1a)，1.34(1H，m，H-1b)，1.67(2H，m，H-2)，1.56(1H，m，H-3a)，1.37(1H，m，H-3b)，1.67(1H，m，H-5)，1.85(2H，m，H-6)，2.79(2H，m，H-7)，3.20(1H，p，J= 6.9 Hz，H-15)，1.19(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.20(3H，d，J= 6.9 Hz，H-17)，3.46(1H，d，J= 11.1 Hz，H-18a)，3.13(1H，d，J= 11.1 Hz，H-19b);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：39.9(C-1)，19.8(C-2)，36.3(C-3)，38.4(C-4)，45.0(C-5)，20.1(C-6)，30.4(C-7)，127.0(C-8)，149.2(C-9)，38.9(C-10)，111.1(C-11)，153.2(C-12)，133.3(C-13)，127.2(C-14)，27.2(C-15)，23.2(C-16、17)，72.0(C-18)，18.0(C-19)，25.7(C-20)。以上数据与文献进行对照，同时经二维核磁谱图进行验证，确定为文献[15]报道的化合物18-hydroxyferruginol 。

化合物2透明油状液体；HR-EI-MS：m/z287.237 7 [M+H]+(calcd for C20H31O，287.236 9)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.15(1H，d，J= 8.1 Hz，H-12)，6.94(1H，dd，J= 8.2，2.0 Hz，H-11)，6.85(1H，d，J= 2.0 Hz，H-14)，3.45(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18a)，3.12(1H，d，J= 11.0 Hz，H-18b)，2.90～2.83(1H，m，H-6a)，2.83～2.76(1H，m，H-6b)，2.35～2.27(1H，m，H-15)，1.89～1.78(2H，m，H-7)，1.70～1.67(2H，m，H-2)，1.55(1H，m，H-5)，1.40～1.29(2H，m，H-3)，1.24～1.19(9H，m，H-16，17，20)，0.88(3H，d，H-19);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：148.6(C-9)，146.6(C-13)，135.9(C-8)，127.7(C-14)，125.2(C-12)，124.6(C-11)，72.0(C-18)，45.0(C-5)，39.8(C-1)，38.9(C-4)，38.4(C-10)，36.3(C-3)，34.8(C-15)，31.1(C-7)，25.8(C-20)，24.5(C-16，C-17)，19.9(C-2)，19.8(C-6)，18.0(C-19)。以上数据与文献[16]报道的dehydroabietanol数据一致。

化合物3白色羽状结晶；HR-EI-MS：m/z427.380 2 [M+H]+(calcd for C30H51O，427.393 4)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：5.15(1H，t，J= 3.7 Hz，H-12)，3.25(1H，dd，J= 11.1，5.2 Hz，H-3)，2.02～1.86(3H，m，H-11，H-18)，1.09，1.03，1.02，0.98，0.94，0.82(3H×6，s，H-22～27)，0.82(6H，s，H-2,30);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：139.8(C-13)，124.6(C-12)，79.2(C-3)，59.2(C-18)，55.4(C-5)，47.9(C-9)，42.3(C-14)，41.7(C-1)，40.2(C-8)，39.8(C-19)，39.8(C-20)，39.0(C-22)，38.9(C-17)，37.1(C-4)，33.9(C-10)，33.1(C-7)，31.4(C-21)，29.9(C-27)，28.9(C-23)，28.3(C-2)，27.4(C-16)，26.8(C-11)，23.5(C-15)，23.4(C-28)，21.6(C-29)，18.5(C-6)，17.6(C-26)，17.0(C-30)，15.8(C-24)，15.8(C-25)。以上数据与文献[17]报道的neolupenol数据一致。

化合物4黄色针状结晶；HR-EI-MS：m/z329.102 4 [M+H]+(calcd for C18H17O6，329.102 0)；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.65(1H，s，5-OH)，8.07(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′和H-6′)，7.02(2H，d，J= 9.0 Hz，H-3′和H-5′)，6.44(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)，6.35(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，3.89(3H，s，-OCH3)，3.87(3H，s，-OCH3)，3.85(3H，s，-OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：178.9(C-4)，165.6(C-7)，162.2(C-4′)，161.8(C-5)，156.9(C-8a)，156.1(C-2)，139.0(C-3)，130.3(C-2′和C-6′)，123.0(C-1′)，114.2(C-3′和C-5′)，106.2(C-4a)，98.0(C-6)，92.3(C-8)，60.3(3-OCH3)，55.9，55.6 (4′，7-OCH3)。以上数据与文献[18]报道的kaempferol 3,4′,7-O-trimethylether数据一致。

化合物5黄色针状结晶；HR-EI-MS：m/z389.123 3 [M+H]+(calcd for C20H21O8，389.123 1)；1H NMR(500MHz，CDCl3)δ：12.91(1H，s，5-OH)，8.02(1H，dd，J= 8.5，2.0 Hz，H-6′)，7.98(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，7.29(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.80(1H，s，H-8)，4.28(6H，s，3′，4′-OCH3)，4.26(3H，s，7-OCH3)，4.22(3H，s，6-OCH3)，4.17(3H，s，3-OCH3)；13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：155.9(C-2)，138.9(C-3)，178.9(C-4)，152.9(C-5)，132.4(C-6)，158.8(C-7)，90.4(C-8)，152.3(C-9)，106.6(C-10)，123.0(C-1′)，111.4(C-2′)，148.9(C-3′)，151.5(C-4′)，111.0(C-5′)，122.2(C-6′)，60.2(3-OCH3)，60.9(6-OCH3)，56.4(7-OCH3)，56.1(3′-OCH3)，56.1(4′-OCH3)。以上数据与文献[19]报道的artemein基本一致。

化合物6黄色针状结晶；HR-EI-MS：m/z359.234 0 [M+H]+(calcd for C19H19O7，359.234 1)1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：12.61(1H，s，5-OH)，7.71(1H，J= 2.0 Hz，H-6′)，7.67(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-2′)，7.05(1H，d，J= 8.4 Hz，H-5′)，6.50(1H，d，J= 1.7 Hz，H-3)，6.01(1H，s，H-6)，3.99(3H，s，-OCH3)，3.96(3H，s，-OCH3)，3.92(3H，s，-OCH3)，3.86(3H，s，OCH3);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：179.1(C-4)，158.9(C-2)，156.1(C-9)，152.9(C-7)，152.5(C-4′)，148.5(C-3′)，146.5(C-5′)，138.9(C-8)，132.5(C-1)，122.8(C-6′)，122.6(C-10)，114.7(C-2′)，111.1(C-5′)，106.7(C-3)，90.5(C-6)，61.0(7-OCH3)，60.3(8-OCH3)，56.5(3′-OCH3)，56.3(4′-OCH3)。以上数据与文献[20]报道的5-羟基-7,8,3′,4′-四甲氧基黄酮数据一致。

化合物7黄色针状结晶；HR-EI-MS：m/z345.096 5 [M+H]+(calcd for C18H17O7，345.096 9)；1H NMR(500 MHz，(CD3)2CO)δ：12.72(1H，s，5-OH)，9.11(1H，s，-OH)，8.05(2H，d，J= 9.0 Hz，H-2′，H-6′)，7.02(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3′，H-5′)，6.80(1H，s，8-H)，3.98(3H，s，7-OCH3)，3.88(3H，s，3-OCH3)，3.80(3H，s，6-OCH3);13C NMR(125 MHz，(CD3)2CO)δ：179.9(C-4)，161.0(C-42′)，160.2(C-7)，157.1(C-2)，153.7(C-5)，153.2(C-9)，139.2(C-3)，133.2(C-6)，131.3(C-22′)，129.4(C-62′)，122.7(C-12′)，116.9(C-32′)，116.5(C-52′)，107.1(C-10)，91.7(C-8)，60.6(6-OCH3)，60.2(3-OCH3)，56.8(7-OCH3)。以上数据与文献[21]报道的penduleti数据一致。

化合物8红棕色粉末；HR-EI-MS：m/z625.213 9 [M+H]+(calcd for C29H37O15，625.212 7)；1H NMR(500 MHz，CD3OD)δ：7.62(1H，d，J= 15.9 Hz，H-β′′′)，7.08(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′′′)，6.98(1H，dd，J= 8.2，2.1 Hz，H-6′′′)，6.80(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′′′)，6.72(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2)，6.70(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.59(1H，dd，J= 8.0，2.1 Hz，H-6)，6.30(1H，d，J= 15.9 Hz，H-α′′′)，5.21(1H，d，J= 1.8 Hz，H-1′′)，4.94(1H，t，J= 9.5 Hz，H-6′)，4.40(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，4.07～3.41(10H，m，H-α、2′、3′、4′、5′、2′′、3′′、4′′、5′′)，2.87～2.77(2H，m，H-β)，1.11(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′);13C NMR(125 MHz，C5D5N)δ：167.6(C=O)，151.1(C-4′′′)，148.2(C-β′′′)，147.7(C-3′′′)，147.3(C-3)，146.1(C-4)，130.9(C-1)，127.5(C-1′′′)，122.8(C-6′′′)，121.0(C-6)，118.0(C-5)，117.3(C-5′′′)，117.0(C-2)，116.3(C-2′′′)，115.3(C-α′′′)，104.7(C-1′)，103.6(C-1′′)，81.1(C-3′)，76.9(C-4′)，76.4(C-2′)，74.5(C-4′′)，73.1(C-2′′)，73.1(C-3′′)，71.8(C-α)，70.8(C-5′)，70.7(C-5′′)，62.6(C-6′)，36.6(C-β)，19.7(C-6′′)。以上数据与文献[22]报道的毛蕊花糖苷数据一致。

化合物9透明油状物；C24H38O4，ESI-MS：m/z391.8 [M+H]+；1H NMR(500 MHz，CDCl3)δ：7.70(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-2，5)，7.53(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，4)，4.26～4.17(4H，m，3′，3′′)，1.68(2H，m，H-4′，4′′)，1.42(4H，m，H-5′，5′′)，1.37～1.23(12H，m，H-6′，6′′，7′，7′′，8′，8′′)，0.91～0.89(6H，m，H-12′，12′′);13C NMR(125 MHz，CDCl3)δ：167.9(C-1′，1′′)，132.6(C-1，6)，131.0(C-3，4)，129.0(C-2，5)，68.3(3′，3′′)，38.9(4′，4′′)，30.5(C-11′，11′′)，29.8，29.1(C-9，9′)，23.9(C-5′，5′′)，23.1(C-6′，6′′)，14.2(C-10′，10′′)，11.1(12′，12′′)。以上数据与文献[23]报道的邻苯二甲酸-二-(2-乙基己基)酯数据基本一致。

化合物10透明油状物；HR-EI-MS：m/z279.159 0 [M+H]+(calcd for C16H23O4，279.159 1)；1H NMR(500 MHz，CD3OD )δ：7.75(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-3，6)，7.64(2H，dd，J= 5.7，3.3 Hz，H-4，5)，4.32(4H，t，J= 6.6 Hz，H-8，8′)，1.75(4H，m，H-9，9′)，1.53～1.44(4H，m，H-10，10′)，1.01(6H，t，J= 7.4 Hz，H-11，11′);13C NMR(125 MHz，CD3OD)δ：169.3(C-7，7′)，133.6(C-1，2)，132.4(C-4，5)，129.9(C-3，6)，66.7(C-8，8′)，31.7(C-9，9′)，20.3(C-10，10′)，14.0(C-11，11′)。以上数据与文献[24]报道的邻苯二甲酸二丁酯的数据一致。

2.2 抗炎活性结果

所述单体化合物的抗炎活性测定结果显示，化合物1、2、4、10具有一定的抑制NO生成作用，其IC50值分别为25.2、34.6、109.6、104.8 μmol/L。其中，两个松香烷型二萜(化合物1、2)较其他化合物有着更好的活性效果，而化合物5、8、9均未表现出显著的抑制NO生成作用。

3 结论

本实验从长叶紫珠中分离并鉴定出10个化合物，包括二萜类化合物、三萜类化合物、黄酮类化合物、苯乙醇苷类化合物、芳香族化合物。10个化合物均为首次从长叶紫珠中分离得到。抗炎活性实验结果表明，部分化合物具有一定的抗炎活性，这提示我们长叶紫珠具有较大的被开发利用的潜能。通过对长叶紫珠的化学成分及抗炎活性进行研究，为明晰长叶紫珠化学的成分构成及药效物质基础提供了依据，同时也为长叶紫珠的开发利用提供一定参考依据。