动物脾脏发育研究进展

汪富文,罗小雨,王朝飞,杨 鸽,雷初朝,党瑞华

(西北农林科技大学 动物科技学院,陕西 杨凌 712100)

脾脏由结缔组织和淋巴组织组成，是一个复杂外周淋巴器官，具有高度组织化的区域和复杂的微循环系统。脾脏在动物机体中承担着存储免疫细胞、滤血和储血的重要作用，全面了解脾脏的解剖学、生理学和发育，对于确定支持脾脏疾病和先天性变异的病理生理机制至关重要。随着现代生命科学的发展，对于脾脏的研究越来越深入，研究者发现不同物种脾脏的大小、形状和组织结构有着明显的差异。当前对脾脏的研究主要集中在人类和模式动物上，家畜和其他哺乳动物上尚没有特别深入，物种间脾脏的差异程度和具体功能仍然存在争议，深入探究家畜脾脏的功能和生长发育的具体机制能够有力地推动家畜抗病性状的遗传选育。本文系统总结了目前关于脾脏发育的知识及当前研究中和脾脏发育有着密切联系的基因，以期对哺乳动物脾脏的研究及家畜抗病育种提供一些参考资料。

1 脾脏的组织学结构

脾脏主要由白髓(white pulp, WP)、红髓(red pulp, RP)和边缘区(marginal zone，MZ)3个部分组成[1]。这3个部分的结构和细胞组成都有较大的差异，在动物免疫应答过程中发挥着不同的作用。白髓约占脾脏体积的25%，其中密集地分布着各类淋巴细胞，白髓小室由含有较多T细胞的淋巴鞘和富含B细胞的滤泡组成。淋巴鞘在中央小动脉周围分布较多而B细胞滤泡主要分布在血管分支处[2]。脾脏的红髓由静脉窦、髓索和动脉系统的终末支组成。髓索是一个巨噬细胞网状结构，具有相互连接的细胞质突起。髓索和静脉窦紧密相连，静脉窦的结构很特殊，由内皮细胞通过应力纤维连接到细胞外基质形成。这些应力纤维之间会形成缝隙，红细胞必须通过这些缝隙才能重新进入循环，这一独特的结构能够阻止老化或受损的红细胞通过，以便进一步处理这些衰老损伤的红细胞[3]。此外，这一机制也能适当控制血液的流速。脾脏的先天免疫反应主要发生在边缘区，包括两组特殊的巨噬细胞：边缘区巨噬细胞形成外环，金属嗜酸性巨噬细胞形成靠近白髓的内环。边缘区的巨噬细胞表达C型凝集素(DC-SIGN/SIGNR1)和清道夫受体(scavenger receptor)MARCO，这些物质能与某些病原体如结核分枝杆菌和肺炎链球菌的多糖抗原结合，并使其消化降解[4-6]。

2 脾脏的主要功能

2.1 免疫功能

依赖于丰富的免疫细胞类型，脾脏既能完成吞噬细胞为主的非特异性免疫功能，又可以通过T细胞介导的细胞免疫和B细胞介导的体液免疫完成机体的特异性免疫功能。脾脏还能够产生T细胞和B细胞，在二次免疫应答过程中发挥重要作用。红髓具有多种先天免疫细胞，可以作为免疫效应器进行免疫识别和应答，但红髓最主要的功能还是对血液进行过滤，将有害物质和衰老、损伤的红细胞清除[7]。白髓区域是脾脏免疫功能的主要承担者，淋巴鞘和滤泡在免疫反应中共同作为免疫应答的生发中心[8]。淋巴鞘分布有大量的T细胞，可以形成淋巴细胞并且产生浆细胞。滤泡含有较多的B细胞和其他参与免疫过程的细胞，参与抗原的呈递和免疫应答的发生[9]。

2.2 屏障功能

1986年，Weiss等[10]最先报道了与血-睾屏障类似的过滤机制，即血-脾屏障(blood-spleen barrier, BSB)，这一屏障对脾脏免疫功能的有序进行起到了重要的支撑作用。血-脾屏障的结构基础是脾脏红髓特殊的网状结构，其主要的功能主要包括3部分：第一，阻止血液中病原体等有害物质的进入，同时拦截衰老损伤的红细胞，适当控制血液的流速；第二，向白髓区域呈递抗原，促使免疫应答的发生；第三，维持白髓内部环境的相对稳定，调节白髓的免疫功能[8]。

3 哺乳动物脾脏发育生理研究进展

脾脏发生的标志是背侧中纹内间充质的凝结[11]，在小鼠中，脾脏大约在E10.5～11才能被检测到，因为该阶段祖细胞开始在背侧浓缩集聚，位置靠近胃和背侧胰腺。鉴于在早期发育过程中脾脏和背侧胰腺间充质紧密相接，因此在E12.5～13之前很难从形态学上区分这两种组织，往往只有使用脾脏和胰腺的标记物才能准确地去描述[12]。使用早期脾脏间充质细胞标记物对小鼠进行原位杂交分析，发现了一些标记基因，如Tlx1 (T-cell leukemia homeobox 1)、Nkx3-2 (NK3 homeobox 2)、Wt1 (WT1 transcription factor)、Tcf21 (transcription factor 21)、Nkx2-5 (NK2 homeobox 5)、Pbx1 (PBX homeobox 1)和Sox11 (SRY-box transcription factor 11)[13-18]，这些标记基因能够清楚地显示脾脏早期发育的具体特征。脾脏起源于胚胎内脏的中胚层，作为体内最大的外周淋巴器官，当脾脏组织发育完成时，其结构和功能就会进一步复杂化[19]。

脾脏作为重要的免疫器官，与家畜的抗病性状有着密切的联系，因此其发育生理及发育的具体机制也是动物育种的重要研究内容。崇庆庆[20]将云南高峰牛和荷斯坦牛脾脏组织全基因组DNA甲基化作比较分析，筛选出9 474个差异甲基化区域，注释到2 718个差异甲基化相关基因，为两种牛的表型及抗病力差异研究奠定基础。刘银雪等[21]对非洲白犀牛的脾脏进行形态学观察，确定了犀牛和其他动物之间的脾脏形态差异，并就其成因作了推测。谭雪芬等[22]在牦牛脾脏上也进行了类似的形态学研究。关飞等[23]采集牦牛和普通黄牛的脾脏，从解剖学和组织学角度充分展示了牦牛和黄牛的脾脏生理学差异。在羊上，相关研究主要集中在羊脾脏基因和非编码RNA的表达上，对于羊脾脏的发育及组织形态学研究还比较少。周熳琳等[24]探究了血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)在1岁藏羊脾脏的表达情况，发现VEGF广泛分布于藏羊脾脏组织中，可能对藏羊脾脏形态结构和功能的维持具有重要作用。两例F17大肠杆菌感染的湖羊脾脏转录组研究充分展示了感染前后脾脏中lncRNA和circRNA的差异表达情况，对于家养动物的脾脏非编码RNA研究具有重要的意义[25-26]。车天栋[27]以家猪5个不同生长发育时间点和3头成年野猪及其他9种哺乳动物的脾脏组织为研究对象，利用转录组测序技术将39个样本在转录水平上进行研究，鉴定出大量差异表达的lncRNA，解释了在不同生长发育阶段猪脾脏的转录组水平差异。猪作为重要的模式动物之一，在转录组水平上研究其脾脏发育的过程也有助于我们更全面地了解哺乳动物脾脏发育的分子机制。不同物种或者同一物种不同品种脾脏转录水平研究主要反映其脾脏的功能差异[28]，能够推动家畜抗病新品种选育及抗病性状筛选的进程。

4 脾脏发育关键基因研究进展

通过基因敲除小鼠模型已发现了一些重要的脾脏发育基因，这些基因主要是编码转录因子，控制脾脏的功能、形态发生和发育扩张。敲除Tlx1的小鼠为脾脏发育的遗传控制提供首个重要的范例[29]。由于间充质细胞增殖减少[30]，Tlx1突变体胚胎的脾脏原基正常发育到E13.5时期后就停止了继续发育，而Wt1缺失的胚胎中脾脏间充质细胞凋亡会导致脾脏几乎完全缺失[31]。除此以外，NKX2-3、NKX3-2和Pbx1[30-33]的表达也是脾脏发育所必需的，在动物脾脏发育过程中不可或缺。

4.1 NKX2-3和NKX3-2基因

NKX2-3基因编码含有同源域的转录因子，其编码的蛋白质是同源域转录因子 NKX家族的成员。在小鼠中靶向破坏转录因子NKX2-3基因会导致肠道和脾脏发育异常。NKX2-3基因缺失小鼠要么是无脾的，要么是脾脏明显缩小[34]，纯合NKX2-3突变体会缺乏粘膜定位素细胞粘附分子-1(MAdCAM-1)，该分子通常在黏膜相关淋巴组织和脾脏中表达。NKX2-3是脾脏和粘膜相关淋巴组织中MAdCAM-1表达和淋巴细胞迁移所必需的[35]，并干预B淋巴细胞发育和分化[36]，脾脏血管系统的器官特异性模式由NKX2-3调节，其掌控着淋巴细胞归巢机制和脾脏组织特异性的血液过滤能力[37]。除了对细胞和相关分子表达的影响，NKX2-3还会调控白髓的成纤维细胞亚群形成，进而影响脾脏结构发育[38]。

NKX3-2和NKX2-3同属同源域转录因子NKX家族的成员。脾脏和胰腺的侧向性依赖于一个特化的柱状中胚层细胞层——内脏中胚层板，这层细胞能够使得脾-胰腺区域向左生长，而NKX3-2能调节胰腺侧移所需的内脏中胚层的功能[18]。该基因除了调控脾脏的发育，还同时影响着骨骼的生长[39]。

4.2 Pbx1基因

Pbx1基因编码属于转录因子PBX同源盒家族的核蛋白，已有研究证明Pbx1在多条途径上都对脾脏发育进行调控，在脾脏发生中起着核心的分级协同调节作用[30]。Pbx1敲除的小鼠表现为脾发育不全，大多数器官系统发育不正常，且在骨骼上也有缺陷，通常在E15.5/16.5就会死亡[40]。Pbx1的缺失导致脾间充质祖细胞的NKX2-5表达下调，CDKN2B(cyclin dependent kinase inhibitor 2B)基因表达下调，从而扰乱细胞周期。去除Pbx1突变体中的CDKN2B基因可以在一定程度上挽救脾生长，因此，PBX/NKX2-5/p15调节模块对脾脏发育至关重要，Pbx1作用的发挥必然是系统的，需要多个基因之间共同协作[41]。

4.3 Tlx1基因

该基因编码一种核转录因子，属于同源框基因的NKL亚家族。在胚胎发育过程中，编码的蛋白质是脾脏正常发育所必需的，缺失该基因的小鼠仅表现出脾脏发育不全的表型特征[15]。Tlx1依赖的维甲酸(retinoic acid, RA)代谢调节对脾脏器官发生至关重要。在小鼠模型中，在脾脏原基形成过程中Tlx1的缺失会调节几个与RA代谢有关的基因从而增强RA信号，RA活性改变会导致间充质细胞提前分化，脾原基血管生成减少，对Tlx1基因缺陷动物模型的RA信号的药物抑制可一定程度上缓解脾发育缺陷的情况[42]。出生后骨髓外造血(extramedullary hematopoiesis, EMH)是造血干/祖细胞(hematopoietic stem/progenitor cells, HSPCs)在骨髓外发生分化，以应对造血紧急情况的病理过程，Tlx1过表达可诱导EMH发生，并引起脾脏微环境的改变[43]。

4.4 Wt1基因

该基因编码一个转录因子，在C端有4个锌指基序，在N端有一个富含脯氨酸/谷氨酰胺的DNA结合域。Wt1的敲除小鼠表现为脾脏发育不全，且不能够形成肾、心、膈肌和性腺等组织器官，一般在E15就会死亡[31]；幼年和成年小鼠敲除Wt1基因后短时间内，小鼠就会出现肾小球硬化、胰腺和脾脏外分泌萎缩、骨骼和脂肪严重减少、红细胞生成受阻等特征[44]。Wt1基因参与脾脏红髓索内的脾脏红髓巨噬细胞暴露在血流中清除衰老的红细胞的调节过程[45]。Wt1受到MIR-125a的调控，MIR-125a基因敲除小鼠会发展为骨髓、脾脏和外周血髓系细胞扩张的骨髓增殖性疾病，并同时伴有泌尿生殖系统异常[46]。Wt1的表达还受到Barx1 (BARX homeobox 1)基因的调节，Barx1的缺失会导致胃和脾脏的发育缺陷，但是从机制上来说并没有影响其他脾脏发育基因的表达，只特异性下调了Wt1表达量，进而导致脾脏发育的异常[46]。

5 展 望

脾脏是一个极其重要的器官，其发挥的免疫功能是其他淋巴器官和造血器官所不能替代的。大量的研究已经逐渐明晰人类和一些模式动物脾脏的结构和功能，但是关于不同物种之间脾脏的结构及具体功能的差异程度目前还没有深入研究，许多脾脏发育的潜在机制仍然不明确。今后随着高通量测序技术的发展，利用先进的测序技术来研究脾脏发育过程中关键转录因子并挖掘免疫关键基因，这或将会为家畜抗病育种和人类脾脏疾病治疗奠定基础。