软骨组织工程的研究现状及间充质干细胞的修复策略▲

陆定贵

(右江民族医学院附属医院骨外科，广西百色市 533000)

软骨组织由软骨细胞和基质构成，缺乏神经、血管，损伤后自愈能力差，易发生创伤性关节炎，严重者可导致肢体残疾[1]。目前临床上治疗软骨损伤常用的方法有自体或异体软骨移植、人工关节置换等[2]。自体软骨可移植的数量有限，无法满足大面积缺损患者，而同种异体移植常常有较强的排斥反应，疗效欠佳。人工关节虽然在力学上已接近正常关节，但存在假体松动、使用寿命短等缺陷。组织工程学是一门与细胞生物学、材料科学紧密相关的学科，通过组织工程技术将细胞与材料有机结合，构建出有生命力的活体组织来修复病损，以达到与正常组织生物特性最大化的相似[3]。组织工程的研究内容主要包括种子细胞、细胞因子、支架材料。组织工程的概念兴起以来，有关学者一直在尝试运用组织工程技术来修复软骨缺损。软骨组织工程的目的是模拟软骨修复的自然过程，通过对种子细胞、支架、细胞生物活性物质等的调控，促进软骨组织愈合[4]。现对软骨组织工程的相关研究作一综述，并探讨间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)修复软骨缺损的临床应用策略。

1 种子细胞的研究现状

细胞是组织工程中最重要的组成部分，软骨组织工程中常用的细胞有软骨细胞、间充质干细胞、多能干细胞。

1.1 软骨细胞 软骨细胞是软骨内唯一的细胞，具有直接分泌外基质能力，同时来源充足、体外扩增能力强、植入后细胞成活率高，是软骨组织工程修复中理想的种子细胞[5]。软骨细胞来源于自体正常软骨，其制作方法为，将获得的软骨组织切成小块，并在37 ℃的Ⅱ型胶原酶中消化过夜。消化后，收集释放的细胞并在生长培养基中传代培养，以获取足够的细胞用于组织工程。软骨细胞的主要缺陷在于取材时可能会导致新的伤害。同时，获取的软骨细胞在扩增传代过程中去分化明显，逐渐失去其特征并显示出成纤维细胞样特征。但是，已有研究表明，水凝胶3D培养系统可以实现去分化软骨细胞的再分化[6]。

1.2 间充质干细胞 MSCs来源于中胚层，存在于骨髓和脂肪中，具有多向分化潜能和自我更新能力，是细胞治疗的重要工具。MSCs在软骨组织工程中具有多种优势[7]。首先，与软骨细胞不同，MSCs可以快速生长并在较长时间内保持其特性。其次，MSCs能通过损伤部位释放的信号因子来定位损伤部位，随后趋化、迁移至损伤区域，并分化为多种相关的谱系，通过旁分泌活性调节炎症和血管生成，直接分化为软骨细胞修复病损软骨。此外，MSCs产生多种对软骨功能至关重要的基质分子，包括胶原蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖和糖胺聚糖以及各种细胞因子。

1.3 多能干细胞 最近关于胚胎干细胞软骨分化的研究报道吸引了研究者的注意[8]。胚胎干细胞具有无限的自我更新功能和分化成几乎所有细胞类型的能力，可为组织工程修复提供充足的种子细胞，但胚胎干细胞的软骨分化需要复杂的程序，同时存在伦理道德问题[9]。为了避免胚胎干细胞的伦理问题，可以通过重编程体细胞，将其诱导为多能干细胞[10]。诱导多能干细胞已经在动物模型上被证明具有成软骨能力，但是在诱导多能干细胞的生物安全性方面仍有待研究。

2 支架材料

支架在软骨组织工程中的作用包括提供结构支持、增强软骨形成和指导软骨再生。支架可分为天然支架和合成聚合物支架。理想的支架材料应满足以下条件：(1)良好的生物相容性，对宿主无毒，无免疫排斥反应；(2)支架可降解性及其降解速率可控性，降解的产物相对无毒性；(3)支架自身有利于细胞的黏附、增殖及细胞外基质的分泌；(4)良好的可塑性及一定的机械强度[11]。聚羟基乙酸、MSCs及软骨衍生的细胞外基质、水凝胶、羟基磷灰石、聚羟基烷酸酯是组织工程常常应用的人工可降解支架材料[12]。

目前，已有许多天然和合成聚合物被用在软骨组织工程支架研发中。天然聚合物(如胶原蛋白、壳聚糖、丝素蛋白、藻酸盐、透明质酸和硫酸软骨素)具有出色的生物相容性和生物降解性，适合启动快速再生过程[13]。但是，天然聚合物潜在的病原体传播、免疫原性和机械性能较差限制了其临床应用。而合成的聚合物可以人为地调节聚合度，从而控制其机械性能、内部结构和降解，可以有效地促进再生过程[14]。聚乳酸、聚乙醇酸、聚丙交酯-乙醇酸和聚己内酯是三维支架用于软骨组织工程中最常用的聚合物[15]。

组织工程支架的适用性由许多相关因素决定。生物材料应具有生物相容性和细胞启发性，具有多孔性和孔隙连通性，有利于细胞迁移和营养物质及组织废物的运输。对于承重组织的工程，支架需要具有特定的机械性能和确保机械刺激转移到细胞以指导其分化。实现这些设计目标是具有挑战性的，但或许可以通过集成计算工具如有限元建模与三维打印技术来实现，以评估支架结构和材料特性如何影响植入物的性能。但这需要探索不同纤维直径、间距和放置方式对生物支架的结构和力学性能的影响[16]。

3 细胞因子

细胞因子是软骨组织工程的三要素之一，良好的细胞因子对干细胞或软骨细胞具有极佳的生物相容性，可促进干细胞趋化、黏附、定植、增殖、分化为软骨细胞并分泌软骨基质。软骨组织工程修复过程是由多种细胞因子之间共同作用的结果，目前研究较为深入的细胞因子主要有转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)、成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor，FGF)家族和血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)、骨形态发生蛋白质(bone morphogenetic protein，BMP)[17]。

TGF-β由两条相同或相似的肽链组成，分子量为25 kDa。TGF-β是间充质前体细胞软骨形成的主要引发剂之一，并且MSCs向软骨细胞的分化也需要其刺激。同时，TGF-β具有诱导软骨细胞合成蛋白聚糖和合成Ⅱ型胶原蛋白的功能[18]。TGF-β有三种同工型(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)，其促进软骨分化的能力没有显著差异，并且TGF-β促进软骨形成分化主要取决于第一周的刺激程度[19]。

IGF有IGF-1和IGF-2两个亚型。研究证明IGF的两个亚型均能促进软骨细胞增殖，刺激软骨细胞外基质，对软骨修复有益[20]。特别重要的是，IGF-1能够独立地诱导MSCs向软骨细胞分化。与单独使用IGF-1相比，将IGF-1和TGF-β1协同使用对透明质软骨的形成具有更好的作用，并出现改善的细胞排列[21]。此外，IGF-1和BMP-2协同使用时可促使分化后的细胞高表达Ⅱ型胶原蛋白、降低基质金属蛋白酶表达[22]。而IGF-1与其他生长因子联合用于体内软骨修复和最佳递送策略仍有待充分阐明。

FGF与软骨细胞增殖、基质合成、细胞稳态密切相关。FGF-2是FGF家族最受关注的代表性成员。在体外环境中，FGF-2上调MSCs的SOX9基因表达水平，从而通过启动软骨分化机制加速细胞分化[23]。有研究将FGF-2掺入纤维蛋白凝块并植入软骨损伤处，证明了其可促进关节软骨的再生修复。但是，FGF-2与BMP-6或TGF-β组合时会抑制后者诱导软骨分化的能力[24]。因此，FGF与其他生长因子在软骨形成分化过程中的相互作用尚待进一步研究。

PDGF对间充质来源的细胞具有有效的促有丝分裂和趋化作用。PDGF-BB干预的软骨细胞以剂量依赖性方式显著增加，并且增强了软骨基质的产生。在动物实验中[25]，PDGF可显著增强兔子模型中软骨缺损部位的透明软骨再生。机制可能是PDGF上调了一种与细胞生长和迁移有关的蛋白(G蛋白偶联受体激酶互作蛋白1)，随后促进了软骨细胞的增殖和迁移。然而，在人软骨细胞中加入PDGF会刺激去分化相关基因的表达，因此，需要进一步评估PDGF在软骨组织工程学中的益处。

BMP是TGF-β超家族的成员，因此也可以通过TGF-β经典的Smad和非Smad途径诱导干细胞分化，形成软骨并促进软骨基质的合成[26]。目前已有许多BMP的亚型被发现，其中BMP-2、BMP-4、BMP-6和BMP-7在软骨组织工程领域的研究最广泛。BMP-2在整个软骨形成过程中都高度表达。因此，其已普遍用于改善体外和体内软骨的再生。但BMP不同亚型诱导软骨再生的能力仍然存在争议，大多数BMP还可诱导成骨，由此引起的异位骨化是一个重要的问题，需要进一步研究并加以克服。

4 间充质干细胞的修复策略

软骨组织工程常用的种子细胞是MSCs和自体软骨细胞。MSCs易于从组织中分离，体外扩增能力强，且具有很强的成软骨潜能，成为软骨组织工程中最具修复能力的种子细胞[27]。广泛的临床前试验已经证实，MSCs在软骨分化因子的作用下可以分化为软骨组织，可修复受损的软骨。

用于软骨修复的MSCs可以从外源性获取或内源性获取。内源性获取MSCs主要是通过微骨折手术，采用克氏针在软骨下骨板上钻孔，以打通软骨下骨髓腔，通过炎症作用，刺激骨髓腔里的MSCs趋化、定植于损伤区[28]。外源性获取MSCs是通过宿主的其他组织获得MSCs，然后通过手术切口或关节内注射植入关节中，以进行小规模的软骨修复。不论MSCs是外源性或内源性来源，都需要趋化、迁移、定植于损伤区，才能发挥细胞代谢功能、修复作用，这一过程称为“归巢”。

组织修复过程需要有足够数量的细胞归巢到靶组织。然而，不论是外源还是骨髓迁移途径，仅有小部分移植细胞能到达靶组织，且移植细胞存活率极低[29]。归巢包括非系统归巢和系统归巢。非系统归巢是指细胞在靶组织内移植，然后通过趋化因子浓度梯度引导到靶组织；系统归巢是移植细胞被管理或内源性招募到血液中，经过多步骤的过程，以退出循环和迁移到损伤部位。研究表明[30]，经外周静脉移植的干细胞在移植15 min后有80%存在于肺组织。4 d后，移植细胞呈指数下降至0.01%。另外，介于损伤区域自由基产生、免疫炎性反应等，趋化迁移来的移植干细胞约7 d内凋亡[31]。MSCs虽然具有修复受损组织、储存生长因子和再生分子的能力，然而MSCs归巢效率低下，归巢消耗是实现MSCs完全治疗潜力的主要瓶颈[32]。

MSCs治疗所面临的最大挑战之一是提高其归巢效率。MSCs的归巢机制目前已知其涉及滚动、激活、俘获、穿越、迁移等步骤[33]，但尚不清楚哪些步骤是MSCs消减的主要瓶颈。目前已采取多种方法来改进MSCs归巢。这些策略可大致分为七种：(1)靶向给药；(2)磁引导；(3)基因修饰；(4)细胞表面工程；(5)体外启动；(6)靶组织的修饰；(7)放射治疗技术[34]。这些策略中有一些侧重于非系统性归巢，如靶向给药和磁引导。每种方法都有自己的缺点，而且因靶组织的不同，靶向给药的作用有限。对MSCs的修饰也并不能完全阻止其分布到非靶器官。另一方面，通过化学或基因手段改变靶组织会引起安全问题。目前也有观点认为利用超声增强MSCs归巢是一个有效途径，可以很容易地进入靶向深部和浅部器官，但这一观点仍需更多的研究支撑。

虽然归巢可能是实现MSCs疗法的主要障碍，但其他障碍也同样存在。在临床设置中使用的MSCs来源于健康的供体，尽管这些细胞在定义表面标记的表达中可能是均质的，但它们的功能并不一定是均质的。此外，MSCs的大规模体外扩增会导致衰老，削弱其治疗效果[35]。临床试验几乎普遍使用刚解冻的MSCs。冷冻保存易损害MSCs的免疫抑制特性，并缩短它们在体内的维持时间[36]。

5 结 语

软骨组织工程学的出现，拓展了软骨缺损治疗的方式方法，有望克服目前软骨损伤临床治疗的缺点。目前软骨组织工程的支架材料和细胞因子研究已经取得很大进步，且成功开发出各种基于聚合物支架的控释系统，并用于控制生长因子的递送，以促进软骨再生。而基于MSCs作为种子细胞的软骨组织工程细胞来源得到了充分保障，同时具有出色的软骨分化能力，规避了当前临床治疗的局限性。但是仍需注意还有诸多难点有待解决，例如如何促进细胞归巢、如何提高移植细胞的存活率及其活性等。虽然仍有许多工作要做，但这些研究将继续推动细胞治疗领域的发展。