病毒核酸试剂盒开发的质量控制

姚燕丽，吴静标，潘晓芳，韩芝斌，柯杰驰

广东省医疗器械质量监督检验所 （广东中山 528437）

根据2019年中华医学会检验医学分会和国家卫生健康委员会临床检验中心联合制定的《液体活检在临床肿瘤诊疗应用和医学检验实践中的专家共识》[1]，检测已知、单个靶向治疗敏感或耐药型突变时，建议使用突变扩增系统（amplification refractory mutation system，ARMS）。聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）凭借原理简单、操作性强、价格较低、灵敏度高、特异度好、及时方便的优势成为现阶段伴随诊断的主流技术，在基础研究以及医学诊断、法医学和农业科学等各大领域的应用广泛。PCR作为临床诊断的金标准技术，还被广泛应用于血站核酸检测、疾控核酸检测、临床核酸检测等领域，其中，在传染病诊断和血筛检测中能够缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测，相比于传统的免疫诊断方式，其具有不可替代的优势，且基于PCR 的分子诊断是医院对传染性疾病诊断的金标准[2]。

实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是目前应用最成熟、分子诊断临床应用最广泛的技术平台，尤其是在传染性疾病（病毒性肝炎、性病和其他病菌/病毒类等）和肿瘤伴随诊断领域[2]。据不完全统计，截至2020年11月11日，国家药品监督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）共批准了846个PCR 类产品，其中qPCR 产品占比高达86.54%。在伴随诊断领域，NMPA 批准的伴随诊断产品中有60%都是基于qPCR，而在美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration，FDA）批准的46个伴随诊断产品中，基于qPCR 的产品占比也高达 32.61%（15个）。

产品委托检验是体外诊断试剂盒上市前产品性能验证重要且不可或缺的一个环节，是产品第一次走出企业、真正面临第三方的质量考验。产品检验过程中总是会出现一些共性问题，作为第三方注册检验机构，本研究从试剂盒产品性能评估的企业参考品的设计过程质量控制和病毒核酸检测试剂制样过程、扩增条件的优化过程质量控制这两方面的共性问题进行总结讨论，阐述企业在试剂盒研制中可能要注意的质量控制点。

1 企业参考品设计过程中的质量控制

1.1 企业参考品的原料

企业参考品的原料应尽可能与待检样本基质一致并尽量使用临床真实灭活样本，但考虑到多数病毒的生物传染性，采用临床样本时应充分有效灭活以防止其成为新的传染源[3-5]。在企业的实际研发中，对到底采用合成质粒还是病毒样颗粒作为企业参考品的原料一直有争议。在使用企业参考品检测试剂盒性能时，如果使用合成质粒将无法监控核酸提取和逆转录过程，使产品可能处于失控状态，而使用病毒样颗粒则可以模拟病毒的全过程，进行有效的产品质量控制[6]。

此外，企业参考品的原料应该经过定值并有相应的定值溯源过程[7]。目前，采用人工合成基因大多使用紫外分光光度计检测并计算分子数的方法，此方法会存在极大的误差，直接影响到检测限的确定，从而导致产品性能评估误差，影响临床使用。故在进行定值时应该选择更可靠的方法，如将目标核酸与已有国际/国内标准物质的核酸合成为一个基因组，并用国际/国内标准物质作为标准曲线进行量值传递来实现，从而更有效保证产品质量。

1.2 企业参考品

通过对企业参考品中阳性参考品、阴性参考品、精密度参考品、检测限参考品的合理设置可以对检测试剂盒产品的性能指标进行有效评估，同时也是企业出厂检验和质量控制的主要手段。

1.2.1 阳性参考品

阳性参考品反映产品检测不同浓度的阳性样本的能力，即产品准确性，一般由高、中、低不同浓度样本组成[4-5]。在病毒核酸检测试剂中，阳性参考品一般可以将临界值的样本设置为弱阳性参考品，将接近检测上限或医学上限的浓度设置为强阳性参考品，在弱阳性参考品和强阳性参考品之间选择设置中阳性参考品[8]。

1.2.2 阴性参考品

阴性参考品主要考察产品的特异性，应尽可能包括干扰样本和健康人样本[8]。干扰样本分为内源性和外源性，应是与待测物可能发生干扰的物质、病原体或与取样过程中相关的微生物、相似症状的病原体、相关治疗药物的不同浓度的样本。部分的体外诊断企业采用了合成质粒而不是灭活病毒作为阴性参考品，这种方法对于特异性的验证是不利的，因为合成的质粒只是病毒的基因片段而不是全序列基因组，并不能全面评估试剂盒的特异性。

1.2.3 精密度参考品

精密度参考品反映了产品的重复性，一般包括不同浓度的弱阳和中阳性样本。在检测次数上一般为检测10次，通过计算10次检测的变异系数（coefficient of variation，CV）确定试剂盒的精密度，一般产品的精密度≤10%[9-10]。

1.2.4 检测限参考品

检测限参考品是评价产品的一个重要指标，体现产品检测灵敏度。确定检测限需要进行大量的样本测试和统计学分析，而检测限参考品则只是对已确定的检测限进行验证。在企业参考品中至少应该设置3个不同梯度的检测限参考品，每个检测重复3次，直至不能全部检出为止[9-10]。

2 产品设计过程中的质量控制

试剂盒大部分是由核酸提取试剂、扩增试剂、质控品组成，各个成分的开发环节与质量控制密切相关，而对制样过程和扩增条件的优化直接影响试剂盒质量[3]。

2.1 制样过程

2.1.1 核酸提取试剂

核酸提取试剂一般包括蛋白壳的裂解、洗涤、洗脱等步骤。部分病毒属于单链核糖核酸（single-stranded ribonucleic acid，ssRNA）病毒，容易被提取过程中的RNA酶降解[11]，需要加入RNA 酶抑制剂并对提取的过程进行充分优化，同时在产品说明书指定配套的提取试剂，以保证扩增样本质量。在应用过程中，大部分企业只提供扩增试剂和质控品，对于提取试剂的适配性没有充分研究，同时因为病毒的基因组比较短[11]，若不对提取过程进行质量控制监控，如再遇到内标设置不当时，则难以保证核酸提取的纯度。因此，应对配合使用的核酸提取试剂/方法的提取效率、提取核酸纯度等做充分的验证。

2.1.2 质控品

质控品需要参与提取，是扩增质量控制的有效手段之一。质控品一般由含检测目标的阳性质控和不含检测目标的阴性质控组成。质控品首先推荐充分灭活的临床样本，其次为病毒样颗粒，并保证质控品与样本检测同时进行，提高检测的准确性。质控品的浓度选择是检测过程中产品特异性、检测限、准确性的集中体现，质控品的浓度过高不仅可能产生额外的污染，还无法评估检测能力，而质控品的浓度过低则可能导致检测失败，从而导致更多的复测，一般高于试剂的检测限浓度5倍即可，具体还需参考产品的重复性参考品进行设置[11]。

2.2 扩增条件的优化

扩增试剂质量的高低是检测成功与否的关键。扩增试剂主要由缓冲液、逆转录酶（检测RNA 病毒时）、聚合酶、引物探针组成，同是应尽可能加入防污染的酶系，有效防止PCR 产物污染。退火、变性的温度和时间、镁离子浓度（或锰离子）、核酸模板纯度、dNTP 浓度、引物序列和长度的设计都是扩增条件优化需要考虑的因素[12]。

另外，对于试剂盒内标的选择也是影响扩增效果的关键，完善的内标可以监控临床样本从采样、提取、扩增整个完整流程，防止因样本量少、操作不当、试剂失效等因素产生的假阴性，有效提高对应病毒疾病的诊断准确性。一般选择内源性的内标可以监控从采样到扩增的全过程，外源性的内标则最多只能监控从提取到扩增的过程。目前，市场上的部分企业没有设置内源性或外源性内标（如噬菌体），大大增加了假阴性结果和复测的工作量[13]；即使部分企业设置了内源性内标（如看家基因GAPDH 等），但是为了产品出厂检验速度却降低了标准，没有对整个产品进行有效的质量控制。试剂盒同时设置内源性的内标和外源性的内标可以多效监控试剂盒的整个检测过程。

3 小结

企业参考品的设计定值和核酸检测试剂制样过程、扩增条件的优化过程构成了病毒核酸试剂盒的配方开发全过程。配方研发人员首先是产品的设计师，而不只是性能的调试员。配方开发方案的设计，需要与后续产品转产结合起来。首先，企业所开发试剂的生产条件是可实现的；其次，设计开发的配方在生产过程中可能产生的潜在风险是可规避的，即必须结合实际生产过程中会出现的各种问题验证试剂的稳定性；最后，生产企业在产品设计和开发时应充分评估和验证产品的主要原材料，特别是对引物和探针的选择，同时考虑临床样本的复杂性和多样性，进行必要的临床阳性样本的验证，以此来评估试剂盒产品的有效性。只有设计的精确，才能确保配方开发阶段的质量控制无误，这需要研发人员具备较强的产品意识。

试剂盒开发质量控制应始于配方开发之时，贯穿于从产品立项到出厂整个过程中。若配方开发阶段的质量控制是一个静态的过程，那么产品设计转换阶段则是动态的控制过程。而产品的设计转换阶段又可以分为两部分，即工艺设计验证和工艺转换。工艺设计验证是与配方阶段的衔接，是产品可行性的验证，如极端生产环境的验证和风险的调配控制，甚至对配方参数进行进一步的优化。工艺转换更侧重后期量产，要做好放大生产方法的建立、产品批间差控制与生产过程的匹配，放大方法的建立对试剂盒而言最重要的是三大传递的放大，即动量传递、质量传递和热量传递的放大；产品批间差控制包括小试批间差和放大生产后批间差控制，这都对设计转换人员综合素质要求较高，要求其对任何可能导致批间差的物理或化学因素进行排查并解决。

综上所述，试剂盒产品开发的质量控制体现在每一个关键环节的设计理念，体现在对开发细节的控制，同样体现在各个合作部门之间的协作，要求研发人员具备一定的产品意识，生产人员需要有一定的研发思维，设计转换人员则需要起到枢纽作用，保证各个环节连贯不脱节，才能实现真正的质量控制。