饲料中林可霉素检验方法研究

李书华，王艳晓

(河南质量工程职业学院，河南 平顶山 467000)

0 引言

林可霉素为 Streptomycin lincolnensis 所发酵生产中广效型抗生素，可以单独使用或是与 spetniomycin 合并使用，以促进动物生长及改善饲料效率，对于革兰氏阳性菌、霉浆菌及幽门杆菌均具有抗菌作用，常用于治疗禽类及猪呼吸道感染症或水产动物链球菌感染，与红霉素有拮抗作用，不可同时使用。

微生物检测法是最早使用于检测林可霉素的方法，但是其检测的专一性与准确度皆不理想，以仪器来分析林可霉素可得较准确的结果。目前国家标准有关饲料中林可霉素检验是以微生物方法为主，在消费者对食品中动物用药品残留愈来愈重视的今天，急需开发仪器定性定量的方法以避免争议。故本研究以常见的气相层析质谱仪为检测仪器，开发出高准确度与高灵敏度的仪器分析方法。

1 材料与方法

1.1 仪器

安捷伦(Agilent)气相层析仪系统，包括气相层析仪(6890 N)及质谱仪(5973 N)。日立(Hitachi)高效能液相层析系统包括帮浦(L7100)、自动取样器(L7200)、光二极管侦测器(L7450)、试管震荡器(Vortex Gene 2)、12孔吹氮器装置(N-EVAP) 、离心机(KN70) 、纯水系统(Millpore Synergy185) 。

1.2 试药

林可霉素(lincomycin)及克林霉素(clindamycin)，分析级药品，购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)；衍生试剂N-methyl-N(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(MSTFA)，购自Sigma-Aldrich Co.(St.Louis，MO)。甲醇(methanol) LC 级药品、冰醋酸(acetic Acid)、醋酸锌(zinic acetate hydrate) 及黄铁盐(potassium hexcyanolerrate(Ⅱ) trihydrate)皆为试药级，购自Merck KGaA.(Darmstadt，Germany)；去离子水(18 MΩ) 经由Millpore Synergy185纯水系统处理。

1.3 实验器具

15 mL及50 mL PP材质(polypropylene) 含盖离心管，1.5 mL及2 mL微量试管，10 mL及100 mL定量瓶，J.T.Baker 12孔固相萃取装置，0.22 μm 孔径PVDF材质(polyvinylidene fluoride) 针筒过滤膜，OASIS hydrophilic-lipophilic balance(HLB)材质3 mL 60 mg固相萃取匣。

1.4 卡瑞试剂

1)卡瑞试剂Ⅰ，取21.9 g醋酸锌加入3 mL冰醋酸以去离子水定量至 100 mL。

2)卡瑞试剂Ⅱ，取 10.6 g磺铁盐以去离子水定量至 100 mL。

1.5 标准溶液与检量线的制备

正确秤取林可霉素及克林霉素标准品10 mg分别置于10 mL定量瓶中，以甲醇溶解，并定量至 10 mL，为储存溶液(stock solution)。此储存液溶含1 000 μg/mL标准品并存放于2℃～8℃冰箱内，不超过1个月。使用时将林可霉素标准溶液以甲醇稀释至浓度为10 μg/mL、5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.25 μg/mL及0.625 μg/mL，作为检量线溶液。内标准品(internal standard，IS) 克林霉素则以甲醇稀释至浓度为 5 μg/mL。取100 μL 各浓度标准品溶液及5 μg/mL内标准品溶液置于同一个玻璃样品瓶中，以吹氮气装置浓缩干燥后加入100 μL MSTFA，再以铝盖密封后置于烘箱中以 80℃加热 40 min。

1.6 固相萃取测试

将固相萃取匣装置于固相萃取装置中，预先以5 mL甲醇及 5 mL 去离子水平衡(condition)后，依序加入5 mL 10 μg/mL 的林可霉素溶液(溶于5%的甲醇溶液)、2 mL去离子水、2 mL 5%甲醇溶液及5 mL甲醇。分别收集此4部份冲提(eluted) 样品以HPLC检测。

1.7 样品的配制

正确秤取饲料样品5±0.01 g，置于50 mL离心管中，加入25 mL 5%的甲醇，再添加 125 μL 1 000 g/mL克林霉素，振荡 10 min后，以4 000 rpm离心5 min，取上清液5 mL于15 mL的离心管中，加入0.5 mL卡瑞试剂Ⅰ及0.5 mL卡瑞试剂Ⅱ，振荡混合后以4 000 rpm离心5 min。通过以 5 mL甲醇及5 mL去离子水润溼过的固相萃取管柱，以2 mL去离子水冲洗，再以2 mL 5%甲醇洗净后抽干5 min，最后以5 mL甲醇冲出。取0.1 mL甲醇溶液以氮气吹干，再加0.1 mL MSTFA置于80℃烘箱反应30 min，即为待测样品。

1.8 分析条件

液相层析仪分析管柱为 Luna 250×4.6 mm I.D.，粒径为 5 μm，移动相为0.01%磷酸:乙腈=88:12(v/v)，波长设定为 210 nm，以 50 μL 注入仪器分析。

气相层析仪分析管柱为 DB-5MS 30 m × 0.25 mmI.D.入口压力13.2 psi，He流速1 mL/min，温度条件为 injector:300℃，升温程序设定150℃恒温1.5 min，以 20℃/min升温至230℃再恒温3 min，以20℃/min升温至300℃再恒温5 min。总分析时间为15.92 min。以 1 μL 注入分析，分析模式为不分流，以全扫描模式(SCAN) 分析。

2 结果与讨论

林可霉素的分子量为406.54 g/moL，pKa=7.6，易溶于甲醇。在固相萃取方面，本实验选择了3种品牌的固相萃取匣测试，并在各萃取阶段收集分析，因萃取液含有5%甲醇，实验结果显示，大部分C18固相萃取匣在5%甲醇环境下无法将林可霉素完全吸附。本实验共进行3 d的测试，在添加10 μg/g、5 μg/g及1 μg/g的浓度时，相对标准差分别为9.13%、4.00%及13.60%。除了在添加1 μg/g 时的再现性超过10%，其余皆在10%以内。依测试的结果来看，此分析方法的回收率平均为84%、重复性 RSD%平均为7%与再现性RSD%平均为9%，与一般文献中验证的结果差异不大，符合分析方法一般要求，因此可以应用于饲料中林可霉素的检验分析。

林可霉素的分析较少见到以 GC/MS 的分析方法，经 MSTFA 衍生化后可以提高其特异性，有助于增加检测感度。依实验结果来看，此方法具有良好的回收率、重复性与再现性，仪器一次分析时间约16 min而且不需要复杂的前处理，定性定量方面皆优于HPLC 法，亦不须使用LC/MS/MS贵重仪器即能准确的分析，故本方法可应用于饲料中的残留检验。