宏基因组学二代测序技术在感染性呼吸系统疾病病原体诊断中的应用进展

王慧林，刘雪

郑州市第三人民医院呼吸与危重症医学科， 河南 郑州 450000

感染性呼吸系统疾病发病率居各类感染性疾病之首，提高治愈率、降低死亡率的关键仍在于早期明确感染的病原体。目前，病原体培养仍是临床病原学诊断的主要方式，但其有无法检测某些(如苛养菌、部分病毒、胞内菌等)不能常规培养的病原体的局限性。定量聚合酶链反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)则仅能定向检测病毒及部分细菌，对未知病原体不能检测是其缺陷。随着临床检测技术的发展，基于二代基因测序技术的宏基因组学技术在临床应用越来越广泛，并取得一定的进展。现将其在感染性呼吸系统疾病中应用的优势与局限进行综述，期望为临床工作者提供参考。

1 概况

下一代基因测序技术(next-generation sequencing, NGS)又称二代基因测序技术、大量并行测序技术 (massive parallel sequencing, MPS)、高通量测序技术(high-throughput sequencing, HTS)，2008年成功应用于临床诊断新发病原体感染[1-2]，其可直接对临床样本中的核酸进行高通量测序，然后与数据库进行对比分析，从而判断出样本中的病原微生物种类。该技术具有成本低、准确度高(>99%)、效率高(1次可对几百、几千个样本的几十万至几百万条 DNA 分子同时进行快速测序分析)等优势，并且无需特异性扩增[3-7]。它既可在一次测试中同时运行多个不同患者的病原体的全基因组测序，又可以对来自同一个体不同临床样本的多个菌种的基因测序。目前临床应用的基于NGS平台的基因测序方法包括：16S rRNA 、宏基因组学二代测序技术(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)、元转录组学和代谢组学。由于病毒或真菌不携带16S rRNA基因，因此，16S rRNA测序分析仅限于细菌的检测。mNGS可以对样品中遗传成分无限制DNA测序，它不仅可以捕获细菌，还可以捕获基于DNA的病毒和真核DNA，包括真菌微生物。与16S rRNA基因方法相比，mNGS对微生物基因组的不同区域进行测序，将短测序读段组装成更大的片段，可以增加微生物之间的区分能力，从而提高分类学分辨率，甚至物种或菌株水平。临床应用较多的是16S rRNA、mNGS，已纳入检测范围的病原体有8000多种，包括3000多种细菌、4000多种病毒、200多种真菌和140种寄生虫，为感染性疾病尤其是少见病原微生物感染的诊断提供了有效的技术手段。

2 mNGS在呼吸系统感染中的检测价值

2.1 mNGS在呼吸系统感染中不同来源标本的检测应用

在呼吸系统感染中，可用于mNGS检测的标本有静脉血、咽部分泌物、痰液、胸水、肺组织、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)等。其对痰、咽部分泌物、BALF等标本的检测表现出良好的诊断性能[8-9]。就细菌及真菌而言，mNGS检测血液标本的灵敏度及特异度分别为72.7%和89.6%，若血培养联合mNGS，阳性率较单用血培养显著升高[10]。分别用mNGS与组织病理学方法检测肺活检组织，mNGS对真菌和结核分枝杆菌复合体的特异性更高(100.0vs.94.1%)，阳性预测值更高(100.0vs.75.0%)[11]。Miao等[12]对472例感染样本(其中149例(29.2%)来自BALF、143例(28.6%)来自痰液、55例(10.8%)来自胸水、44例(8.6%)实体组织、43例(8.4%)脓及38例(7.4%)血浆)的研究发现，在痰和组织样本类型中，mNGS与常规培养检测方法比较，其敏感性显著升高。在不同样本类型中，mNGS整体敏感性没有差异。其中，非结核分枝杆菌患者的BALF阳性率高于痰液(P<0.01)，结核分枝杆菌、曲霉或隐球菌则无差异。

2.2 mNGS在特定的感染中具有较高的诊断价值

在呼吸系统感染的病原学检测方面，与传统微生物检测方法(BALF微生物培养，涂片显微镜检查和肺活检组织病理学)相比，mNGS能够快速、准确地检测和鉴定病原体，对同时检测数百种已知病原体具有很高的敏感性，但特异性并不优于传统微生物检测方法。Huang等[13]对171例大多为免疫低下的肺部感染患者的回顾性研究认为，mNGS能够识别近89%的肺部感染患者，高于传统的病原体检测方法(25.73%)。但mNGS的特异性较低，为81.16%，而传统方法的特异性为88.41%(P=0.639)。Pan等[14]对13例免疫功能低下社区获得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)患者的对比研究发现，在细菌检测方面mNGS没有显示出明显的优势。然而，mNGS在常规检测方法难以确诊、少见病原体、未知病原体以及在同时检测细菌、真菌和病毒方面显示出了优势。Zhang等[15]对21例心肌炎患者的14个临床样本同时使用mNGS和病原体培养进行检测，发现14个样本的mNGS检测结果均为诺卡菌阳性，而只有5个样本获得了培养阳性结果，9个样本培养失败，住院期间重复培养也未得到阳性结果。该结果表明，与常规方法相比，mNGS在检测诺卡菌时更有效、更灵敏。另外，Chen等[16]也报告了利用mNGS诊断出9例严重的鹦鹉热肺炎。Wang等[17]对55例混合肺部感染患者(其中33例以血液病为基础疾病)进行mNGS检测与常规检测，结果发现，通过mNGS鉴定了5种病原体(脓肿分枝杆菌、根瘤菌、副流感嗜血杆菌、肺炎根瘤菌和肺炎链球菌)，但常规检测未检出；mNGS的敏感性(97.2%)比常规检测(13.9%)显著增高，而特异性(63.2%)比常规检测(94.7%)低。Zhang等[18]研究发现，在13例肺结核病例中，mNGS的敏感性与Xpert相同(62%)，优于传统检测方法(38%)，在胸腔积液中则比Xpert稍差。在16例结核性脑膜炎患者的CSF样本中，mNGS的敏感性为44%，远高于Xpert(19%)和常规方法(19%)。其可能的原因如下。①样品收集和处理的影响。②结核分枝杆菌细胞内生长特性，释放出较少的细胞外核酸。③mNGS高度依赖于覆盖范围，尽管可以识别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌，但由于内部同源性很高，在覆盖率不足的情况下，很难确定结核分枝杆菌复合体中的种类。④抗结核治疗显著降低了诊断敏感性。另外，在非典型病原体方面，mNGS亦显示出了较好的诊断性能[19]。以上研究表明，mNGS在混合感染、免疫抑制患者感染、少见病原体及结核分枝杆菌感染的诊断中具有较高的应用价值。

2.3 mNGS在真菌感染方面的诊断优势

对于真菌感染的检测，传统检查方法常难以满足临床需求。Wang等[17]通过mNGS在55例病例中鉴定出真菌31例(56.4%)，而常规方法检测只有10例(18.2%)真菌阳性。由mNGS鉴定出3例根霉菌，而所有常规检测方法均未检测到。对曲霉菌的鉴定中，mNGS检出的阳性病例数(14例，25.5%)多于常规方法检测确定的阳性病例数(9例，16.4%)。Miao等[12]系统地比较了同标本的mNGS的检测结果和常规培养结果，发现mNGS在检测真菌方面具有更好的可行性[OR，4.0 (95%CI，1.6～10.3)；P<0.01]。Li等[11]对20例肺部感染患者穿刺肺活检组织使用mNGS检测发现，与涂片法比较，mNGS对真菌检测的灵敏度和特异性分别为62.5%(95%CI: 25.9-89.8%)和66.7%(95%CI: 35.4-88.7%)。与培养法比较，mNGS对真菌检测的灵敏度和特异性分别为57.1% (95% CI: 20.2-88.2%)和61.5% (95% CI: 32.2-84.9%)。与组织病理学方法相比，mNGS对真菌检测的特异性和阳性预测值最高达100.0%。此研究虽有样本量小、mNGS的深度以及肺活检组织中存在大量的人类DNA片段等局限，但仍能表明mNGS可以改善肺活检组织中肺部感染性病原体的检测，且在检测速度、敏感性、特异性方面具有潜在的优势。

2.4 mNGS在病毒检测方面的应用价值

常规病毒检测方法如病毒培养、核酸检测等是建立在已知病原体基础上进行的，对未知病毒病原体的检测存在缺陷。而mNGS可快速获得完整的基因组序列，而且靶标不受病原体已有知识的限制，还能准确鉴定新发、突发的病毒性病原体[20]，比传统的病毒检测方法有显著的优势。Lewandowska等[21]认为无偏倚的mNGS可补充特定的常规诊断方法，并增加稀有病毒检出的机会。Thorburn等[8]研究发现，mNGS检测鼻咽拭子中病毒的灵敏度为77.55%，特异性为80.49%。而Anneloes等[22]使用mNGS对63例慢阻肺急性加重期患者的88个鼻咽拭子样本进行了呼吸道病毒分析，24个样本检测为阳性，与PCR相比，诊断目标的敏感性和特异性分别为96%和98%。为了增加通过mNGS获得病毒序列的比例，研究者采用了多种特异性病毒富集方案，如宿主核酸耗竭、平铺多重PCR和捕获探针富集等。Yang等[23]通过Illumina TruSeq RNA Access Library程序，使用大量寡核苷酸探针富集34种呼吸道DNA和RNA病毒进行靶向测序。O’Flaherty等[24]使用了针对常见呼吸道病毒的两个寡核苷酸探针组来减少NGS数据中的非病毒读取，实现病原体鉴定的高性能和与分子分析相当的病毒检测灵敏度。Deng等[25]开发的MSSPE富集方法简单、成本低、快速、与不同的文库制备方案兼容。与其他NGS富集策略相比，MSSPE的扩增偏差较小(～20%重复读数，而其他方法为80%～95%)，样品交叉污染更少。尤其是在以10到107cp ml-1的病毒滴度测试模拟和临床样品时，用MSSPE观察到极少或没有交叉污染。可是该方法没有对冠状病毒、流感病毒进行测试；也没有针对双链RNA病毒、DNA病毒或非病毒病原体进行正式测试，但与其他方案结合使用，可进一步提高检测效能。需要强调的是mNGS测序可以检测细菌、基于DNA的病毒和真核DNA，但由于大多数呼吸道病毒是RNA病毒，因此检测RNA病毒需先转化为互补DNA(cDNA)再进行测序[26]，但在体外逆转录后的测序过程中较易产生系统误差。此外，与来自细菌和宿主的遗传物质相比，RNA病毒遗传物质的丰度相对较低且容易降解，因此对RNA病毒的检测率较低。

3 mNGS在细胞因子检测中的应用

mNGS还可用于细胞因子的检测，庄华东等[27]应用mNGS检测支原体肺炎患儿肺泡灌洗液中Th1细胞因子γ干扰素(interferon-gamma, IFN-γ)、Th2细胞因子白细胞介素-4(IL-4)的表达水平及免疫应答平衡的变化趋势，结果表明支原体肺炎患者中IL-4/IFN-γ比值较支气管异物患者升高，说明感染后免疫调节功能出现紊乱。

4 mNGS在耐药基因检测中的应用

mNGS 数据已经用于筛选抗菌药物耐药基因, Aanensen等[28]、Giulieri等[29]对金黄色葡萄球菌分离株的全基因组学数据进行了流行病学和耐药数据的研究，发展出了在临床感染结局分层和持续性/复发性感染管理方面的潜在临床应用。研究显示mNGS已用于cyp51A基因的高分辨率分析，以鉴定烟曲霉与唑类抗真菌药耐药相关的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)，并进行进化分析。此外，mNGS还被用于研究念珠菌属物种中的唑类和棘皮菌素类抗性菌株。其中SNP分析证实TR 34/L98H突变是引起唑类抗真菌药耐药的最常见原因[30]。Hadjadj等[31]运用全基因组学测序技术对部分常见的容易发生多重耐药的病原体进行了耐药基因检测，如mcr-1、mcr-3、mcr-8可能是耐药肠杆菌科中肺炎克雷伯杆菌的耐药基因传播标志之一。Angela等[32]发现全基因组学可以更全面地识别成功克隆中的新型毒力或抗性因子，并描述了物种基因组具有的高可塑性。但由于抗生素耐药性数据库的更新周期较长和缺乏标准化、耐药机制复杂、耐药基因与实际耐药表型并不完全一致、微生物表达未知的抗菌药物耐药性基因等因素[33]，目前还不能使用mNGS进行常规抗生素敏感性测试。

5 mNGS临床应用的局限性

尽管mNGS具有较大的应用潜力，但由于诸多原因，其临床应用一直落后于研究进展。可能的原因如下。首先，被检测到的微生物是否是污染物，是定植菌还是致病菌，以及是否有人类背景菌的干扰等问题常不确定。虽然研究者使用了诸如mNGS结合16S rRNA靶向测序、多种宿主核酸耗竭法、对实验室试剂定期评估、检测设备擦拭测试、设置阴性对照以及严格遵守试剂使用规范和工作流程质控进行校正等诸多方法，但仍无明显改观。其次，mNGS结果判断尚缺乏公认标准。通常认为微生物的检出序列数、检测深度、检测离散度和基因组覆盖度越高，检测出的微生物的可靠性就越高。然而，对于细菌感染的检测诊断，需排除背景菌、污染菌和定植菌后，方可考虑该微生物是致病病原体；不同的测序平台采用不同的数据库、不同的核酸提取率、不同的检测限度，但临床实际应用时仍难判断；对毒力高、致病性强但检出序列数很低的病原体仍需结合病情及其他临床资料谨慎解读。第三，胞内菌和厚壁微生物的DNA难以释放入血，通常测得的序列数较低，覆盖度亦较低，影响了检测的灵敏性和特异性。第四，如前所述，mNGS检出的结果有时还需借助传统检测方法进行验证。最后，出于成本、周转时间、监管、临床效用等方面的考虑，目前mNGS难以常规应用于临床。

6 展望

mNGS作为一种新兴的检测技术，正越来越多地服务于临床，其覆盖病原体广泛、检测快速、无偏倚、无需特异性扩增的优势，在罕见感染、混合感染、免疫抑制患者感染和常规检测方法难以检测到病原体的诊断中有较高的临床应用价值；但也存在特异性较低、公认判读标准缺乏、测序结果与治疗关系不明确、耐药基因检测困难、价格较高等不足。呼吸系统感染又有着不同于其他部位感染的特性，这无疑增加了提高mNGS临床效用的难度。目前，在临床应用中，mNGS与传统微生物检测技术具有相互补充的作用，两者结合使用能够提高临床诊断效能。随着mNGS技术的进一步发展、临床应用的增加及相关研究的完善，相信它将会被更广泛地应用于临床。

mNGS作为一种新兴的检测技术，正越来越多地服务于临床，其覆盖病原体广泛、检测快速、无偏倚、无需特异性扩增的优势，在罕见感染、混合感染、免疫抑制患者感染和常规检测方法难以检测到病原体的诊断中有较高的临床应用价值；但也存在特异性较低、公认判读标准缺乏、测序结果与治疗关系不明确、耐药基因检测困难、价格较高等不足。呼吸系统感染又有着不同于其他部位感染的特性，这无疑增加了提高mNGS临床效用的难度。目前，在临床应用中，mNGS与传统微生物检测技术具有相互补充的作用，两者结合使用能够提高临床诊断效能。随着mNGS技术的进一步发展、临床应用的增加及相关研究的完善，相信它将会被更广泛地应用于临床。

致谢

感谢上海瑞金医院呼吸与危重症医学科周敏教授在论文修改中给予的指导。