病毒性肺炎患者外周血干扰素刺激基因15 mRNA表达特征的研究

韦栋，陈咏妍，时国朝，张欣欣，王颖

1. 上海交通大学医学院附属瑞金医院感染科临床病毒研究室, 上海 200025； 2. 上海交通大学医学院附属瑞金医院呼吸科, 上海 200025； 3. 上海交通大学医学院上海免疫学研究所, 上海 200025

呼吸道病毒长期以来一直是呼吸道感染的主要致病原之一，其传播给全球公共卫生防治工作造成了巨大的负担。近年来随着病原体诊断技术的提高，越来越多的证据表明呼吸道病毒已经成为社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)的最主要致病原之一[1]。由于呼吸道病毒感染所涉及的病毒种类繁多，其致病机制各不相同，所以目前临床上缺乏使用呼吸道病毒感染的宿主标志物作为辅助诊断的手段。近年来，大量研究证明部分干扰素刺激应答基因的表达水平可能与病毒性感染高度相关[2-3]。干扰素刺激基因(stimulated gene, ISG)15是干扰素刺激应答基因的一员。目前有许多证据表明ISG15与病毒感染，特别是以流感为首的呼吸道病毒感染引起的免疫防御的机制密切相关[4-6]。ISG15可在I型干扰素(interferon-I，IFN-I)刺激下被强烈诱导表达[7]，大量研究已经证实ISG15可以介导多种抗病毒反应，在固有免疫及干扰素调节通路中发挥重要作用[8]。ISG15可以通过结合病毒蛋白来干扰病毒蛋白功能，进一步影响病毒的复制能力[9]；同时，ISG15也可以通过抑制病毒颗粒的释放来干扰病毒感染[10]；除了直接影响病毒复制外，ISG15还可以通过发挥免疫调节作用调节病毒感染期间宿主的损伤和修复反应，间接影响病毒复制及造成的损伤，从而发挥抗病毒作用[11-14]。由于ISG15已经被证明具有广谱抗病毒作用，可以影响包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒、埃博拉病毒和肝炎病毒等多种病毒的复制，因此它在宿主感染过程中的表达变化可能具有重要的临床价值[15]。

本研究同时收集了病毒性CAP和细菌性CAP住院患者临床数据及外周血样本，通过实时反转录聚合酶链反应(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)对不同病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表达水平进行分析，并在体外通过病毒刺激外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)进行验证。探究ISG15同CAP发病机制及疾病活动性之间的可能联系，为临床进一步寻找呼吸道病毒感染的特异性宿主标志物提供依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象

收集2018年11月至2019年6月上海交通大学医学院附属瑞金医院收治的社区获得性肺炎住院患者157例，其中呼吸道病毒感染133例，细菌性感染24例，无细菌、病毒共感染患者，同时在健康体检人群中选取40例作为健康人对照。全部患者诊断均符合中华人民共和国国家卫生健康委员会发布的《中国成人社区获得性肺炎诊断和治疗指南》诊断标准，所有入组患者入院时主诉均为近3～5 d内出现发热症状，且无其他医院就诊经历，入院后均采集鼻、咽拭子进行呼吸道病毒核酸检测及痰液细菌培养以明确病原学诊断。研究入组人员标准包括：发热、咳嗽、咳痰、伴或不伴胸痛；白细胞计数>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴核左移；胸部X线检查或计算机断层扫描(computed tomography，CT)检查显示片状、斑片状浸润阴影或间质性改变，伴或不伴胸腔积液。所有入组患者均无肿瘤病史。相关研究通过上海交通大学医学院附属瑞金医院伦理委员会审核(伦理审批：2018-48)。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物根据美国国立生物技术信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库中甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及ISG15 mRNA全长序列为模板设计引物。ISG15 mRNA 上游引物序列5′-ACCTGACGGT-GAAGATGCTG-3′，下游引物序列5′-TCCTCAC-CAGGATGCTCAGA-3′，产物长度252 bp。内参GAPDHmRNA上游引物序列5′-CGGAGTC-AACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，产物长度307 bp。全部引物均由铂尚生物技术(上海)有限公司合成。

1.2.2 外周血收集及总RNA提取取患者及健康人乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝血1.5 mL，分装后-80 ℃保存，采用TRIzol试剂(天根生化科技有限公司)进行后续的总RNA提取。将200 μL外周血样本与600 μL TRIzol试剂充分混合，室温静置5 min。加入120 μL氯仿，振荡混匀后室温放置3 min，4 ℃ 13 400×g离心15 min，取上层水相层转移至新离心管中，加入等体积异丙醇后混匀，室温静置 10 min。4 ℃ 13 400×g离心10 min，弃去上清液后加入 600 μL 75%乙醇洗涤。4 ℃ 12 000×g离心5 min，完全弃去液体。置室温空气中干燥后加入60 μL去RNA酶水，充分溶解RNA。使用Nanodrop 2000超微量分光光度计(Thermo Fisher公司，美国)进行RNA定量，同时检测其A260/A280比值，当RNA浓度≥10 ng/μL，A260/A280比值≥2时方可进行后续real-time RT-PCR并分析。

1.2.3 实时反转录聚合酶链反应采用HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green逆转录试剂盒(南京诺维赞生物科技有限公司)检测提取合格的RNA中的目的基因表达，反应体系如下：2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1 μL, 上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，加去RNA酶水补齐至总体积 20 μL。采用Light Cycler荧光定量核酸扩增仪(Roche公司，瑞士)进行反应，反应条件为：50 ℃ 15 min(逆转录)，95 ℃预变性 5 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s)×40个循环。ISG15 mRNA的表达水平按照ΔRn值[2-(CT目的基因-CT内参基因)]进行计算获得。

1.2.4 PBMC分离及体外感染实验所使用PBMC来自3位健康志愿者。采用Ficoll淋巴细胞分离液分离抗凝全血，获得的PBMCs经磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次后，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养48 h。待细胞浓度达到6×105/mL，分别使用感染复数(multiplicity of infection, MOI)为0.2、0.02及0.002的甲型流感病毒H1N1病毒株及人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)病毒株(HRV-A)进行感染，于37 ℃、5% CO2条件下分别培养12、24、48、72 h后进行real-time RT-PCR检测病毒载量和PBMCs中ISG15 mRNA表达水平，每组条件设3孔平行试验。病毒载量检测使用罗氏TIB公司呼吸道病毒系列检测试剂盒(Roche公司，瑞士)，并严格按照说明书进行操作。

1.2.5 统计学分析使用SPSS11.0进行统计学分析。多组样本间比较使用方差分析，两组间比较采用t检验，对ISG15 mRNA的ΔRn值与白细胞计数、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、降钙素原(procalcitonin，PCT)结果进行Pearson相关性检验，P<0.05为具有统计学差异。受试者操作特征 (receiver operator characteristic，ROC) 曲线根据阳性率(sensitivity)和假阳性比例 (1-specificity)进行绘制，曲线下面积(area under ROC curve，AUC)值根据95% 可信区间计算获得。

2 结果

2.1 患者基本特征

共收集了157例CAP住院患者(CAP组)外周血样本及40例健康人(健康对照组)外周血样本。157例患者中呼吸道病毒感染患者133例，细菌性感染患者24例。呼吸道病毒感染中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)32例， HRV 23例，呼吸道合胞病毒(respiratory syncy-tial virus, RSV)28例，人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)15例，副流感病毒3型(parainfluenza virus 3, PIV3)14例，冠状病毒(coronavirus, CoV)21例。24例细菌性感染患者痰液样本经细菌培养后均为阳性，其中肺炎克雷伯菌13例、流感嗜血杆菌6例、肺炎链球菌4例、鲍曼不动杆菌1例，全部细菌性感染患者均排除院内感染可能。男性118例(CAP组94例，健康对照组24例)，女性79例(CAP组63例，健康对照组16例)，年龄分布为62.2±21.6岁。CAP组内各类病原体感染者性别和年龄构成均无显著性差异。进一步比较呼吸道病毒感染与细菌性感染患者的各项临床特征，包括年龄、性别、白细胞计数、C反应蛋白及降钙素原水平差异，结果提示呼吸道病毒感染与细菌性感染患者在年龄、性别方面均无显著性差异，白细胞计数与降钙素原水平差异较大，但C反应蛋白差异并不明显。具体情况见表1。

表1 呼吸道病毒感染患者与细菌性感染患者临床特征比较

2.2 不同致病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表达水平分析

采用real-time RT-PCR测定CAP组不同致病原患者外周血中ISG15 mRNA的表达水平，与健康对照组相比，ISG15 mRNA在呼吸道病毒感染组中平均表达水平显著增高，不论是同健康对照组相比或是同细菌感染组相比均有显著差异(见图1A)；而细菌感染组外周血中ISG15 mRNA的水平显著低于病毒感染组，与健康对照组相比差异并不明显(图1B)，提示不同病原体感染可以导致外周血ISG15 mRNA的差异性改变。

进一步将各类呼吸道病毒感染患者进行分组，对其ISG15 mRNA表达水平进行分析，结果发现IAV、RSV、MPV及PIV3感染组患者外周血ISG15 mRNA表达水平较健康对照组显著增高，其中IAV组与RSV组表达水平增高最为显著(见图1C—1F)，而HRV及CoV感染患者ISG15 mRNA表达水平与健康对照组相比无显著差异(见图1G—1H)。

A: Respiratory virus infection group and healthy control group. B: Respiratory virus infection group and bacterial infection group. C—H: In order as follows: influenza A virus infection group (IAV), respiratory syncytial virus infection group (RSV), parainfluenza virus infection group (PIV), human metapneumovirus infection group (MPV), human rhinovirus infection group (HRV), coronavirus infection group (CoV). The different ISG15 mRNA expression levels in peripheral blood of patients with different respiratory infections compared with healthy control. *** P< 0.005

2.3 外周血ISG15 mRNA水平在呼吸道病毒感染诊断中的价值

分别对成人CAP患者中呼吸道病毒感染与细菌性感染、呼吸道感染与健康对照组的外周血ISG15 mRNA进行ROC曲线绘制。结果显示外周血ISG15 mRNA用于区分CAP组患者呼吸道病毒感染的ROC曲线下面积可达73%(P=0.002，见图2A)，而包括健康对照组在内的全部人群中，外周血ISG15 mRNA诊断呼吸道病毒感染的ROC曲线下面积可达到77.5%(P=0.03，见图2B)。上述结果表明，外周血ISG15 mRNA在成人CAP患者呼吸道病毒感染与细菌性感染的鉴别诊断中具有较好的潜在应用价值。

2.4 外周血ISG15 mRNA水平在病毒性感染不同阶段的动态表达特征

为了进一步研究外周血ISG15 mRNA表达在呼吸道病毒感染期间是否会随宿主病程变化而发生改变，选取12例IAV患者、8例RSV患者、5例MPV患者及3例PIV3患者，分别收集其入院时、入院3 d及治愈出院时3个时间点的外周血样本，对其外周血ISG15 mRNA表达水平进行动态检测。结果显示，呼吸道病毒感染患者在感染早期至恢复期间，外周血中ISG15 mRNA表达水平变化较为恒定，至患者出院时，其外周血ISG15 mRNA表达依旧维持在较高水平(见图3)。这提示CAP患者发病后，其外周血ISG15 mRNA表达将在相当长的时间内维持高水平，包括患者痊愈后。

A: Influenza A virus infection. B: Respiratory syncytial virus infection. C: Human metapneumovirus infection. D: Parainfluenza virus infection.

2.5 PBMCs经体外刺激后病毒载量与ISG15 mRNA表达水平的变化趋势

基于临床患者在不同呼吸道病毒感染后外周血ISG15 mRNA表达水平并不一致，其中IAV、RSV、PIV3及MPV感染后ISG15 mRNA表达显著高于HRV及CoV感染，因此分别选择IAV及HRV为代表，在体外感染PBMCs后观察病毒载量和ISG15 mRNA表达水平的变化情况。使用不同MOI(0.2，0.02与0.002)的IAV H1N1亚型病毒株及HRV-A型病毒株感染来自健康志愿者的PBMCs，分别在感染后12 h、24 h、48 h与72 h时检测病毒RNA载量及ISG15 mRNA表达情况。结果表明，IAV感染PBMCs后，PBMCs中的ISG15 mRNA表达水平与IAV病毒复制水平呈正相关(见图4A—4B)，该结果与临床数据一致。但用HRV感染细胞时，高MOI(0.2与0.02)HRV-A毒株感染PBMCs后其ISG15 mRNA表达水平可随HRV RNA复制水平增高而轻度增高，但在低MOI(0.002)HRV-A毒株感染细胞后，ISG15 mRNA表达水平并未出现明显增高(图4C—4D)。

A: Influenza A virus RNA replication. B: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by IAV. C: Rhinovirus (HRV) RNA replication. D: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by rhinovirus

3 讨论

本研究探究了不同病原体感染情况下CAP患者外周血ISG15 mRNA的表达差异，发现在细菌性和病毒性CAP患者之间其外周血ISG15 mRNA表达差异显著，这表明外周血ISG15 mRNA可能具有作为部分病毒性感染特异性标志物的潜在应用价值。进一步分析结果表明，部分RNA病毒(IAV、RSV、MPV及PIV3)感染与外周血ISG15 mRNA表达水平相关性更高，而细菌性感染患者及健康人群外周血中ISG15 mRNA表达基本不发生变化，提示至少在部分病毒所导致的成人CAP感染中，外周血中ISG15 mRNA表达水平可特异性增高，ROC曲线分析也证明检测外周血ISG15 mRNA表达水平对于呼吸道病毒感染具有相当高的诊断效率。这一结果也与ISG15在既往研究中所表现出的广谱抗病毒作用相吻合，与部分国际研究结果一致，同时也证实了病毒性感染和细菌性感染所诱导的免疫应答的特征是不同的[16]。病毒感染可导致免疫细胞分泌大量IFN-Ⅰ，进而诱导ISG基因表达，从而在患者免疫细胞中可检测到大量ISG基因表达上调；而细菌感染主要诱导炎症因子产生，所以外周血免疫细胞中上调的基因表达谱与病毒感染的不同。因此在CAP患者中可利用此不同类型的基因应答谱，制订临床上病原体鉴别诊断的新策略。这也进一步证明ISG15的作用及调控机制同病毒感染高度相关[17]。

然而，通过对临床数据的研究，发现HRV与CoV感染患者外周血ISG15 mRNA表达水平无显著变化。本研究中所涉及的6种病毒均为RNA病毒，其中流感病毒分属正黏病毒科，副流感病毒、呼吸道合胞病毒及偏肺病毒均属副黏病毒科，而鼻病毒与冠状病毒分属小RNA病毒科及冠状病毒科。外周血中ISG15 mRNA在不同病毒感染之间的表达差异可能是由于各类病毒种属间差异所导致的宿主免疫识别机制的差异所造成。虽然本研究未测定这些病毒感染后IFN以及其他细胞因子的表达水平是否存在差异，但是不能排除ISG15 mRNA的表达在不同病毒感染下的调控机制存在差异。有研究表明胞内ISG15不仅作为干扰素的应答基因参与抗病毒应答，同时也是负反馈调控干扰素表达的重要机制之一，它可以通过USP18促进I型干扰素信号通路的衰减，从而避免应答过强[8]。本研究中HRV与CoV在临床感染患者外周血中表现出的低水平ISG15 mRNA表达可能与此两种病毒感染对IFN通路的低刺激所导致的较弱的负反馈表现有关，但该假设需要进一步的体外实验数据支持。值得注意的是，在体外感染PBMCs模型中，ISG15 mRNA表达水平在高MOI的HRV感染情况下同样增高，这一结果与之前的临床数据并不完全一致，但在低MOI刺激下，PBMCs的ISG15表达确实无明显变化。此外，近期有研究同样发现，在新型冠状病毒感染患者的浆细胞中ISG15 mRNA表达水平同样发生了显著上调[18]。由于HRV与CoV在临床上的致病性显著低于其他4种病毒，因此，我们推测造成临床HRV与CoV感染患者外周血中ISG15 mRNA表达水平无显著变化的原因也可能与其感染后的致病情况相关：呼吸道病毒感染后所造成的宿主损伤越严重，免疫反应越强烈，其ISG15表达水平的上调便越显著。

本研究还探讨了外周血中ISG15 mRNA表达是否会随患者的病程变化而动态波动。通过对不同时间点CAP住院患者外周血ISG15 mRNA的检测发现，患者感染初期ISG15 mRNA表达升高后便会持续性地维持在较高水平，直至患者治愈出院时也未见回落。上述结果也表明宿主免疫系统一旦感知外源性病毒感染后，可以维持相当一段时间的免疫应答水平特征。其中的机制包括转录水平的改变，还有可能通过表观遗传学或是代谢调控维持相关基因的开放，从而维持应答基因的水平[7]。

近年来，大量研究阐明了ISG15在急性和潜伏性感染中的抗病毒机制，这进一步提高了人们对ISG15在病毒感染中如何发挥免疫防御功能的理解，包括描述ISG15如何改变疾病发病机制，限制组织损伤和调节IFN-I信号通路的能力[19-21]。此外，最近对ISG15缺失患者的研究以及随后对ISG15调控IFN-I信号的总结，揭示了这一途径的复杂性，提示需要重新评估ISG15在抗病毒过程中的作用[8, 22-23]。本研究结果表明，外周血ISG15 mRNA高水平表达与呼吸道病毒感染相关，在呼吸道病毒和细菌所诱导的CAP的鉴别诊断中具有潜在的应用价值；结合ISG15在病毒性感染患者中的表达特征，可为了解ISG15的抗病毒机制，深入解析ISG15及其他ISG家族蛋白在抗病毒免疫调节中的作用提供重要线索；也为呼吸道病毒感染的临床诊疗提供了新的思路。