纳米示踪剂在移植干细胞活体示踪中的研究进展

黄思渝， 成 昱， 秦 瑶

(1. 同济大学医学院，上海 200092； 2. 同济大学附属东方医院再生医学研究所，上海 200123； 3. 同济大学附属东方医院干细胞转化医学产业基地，上海 200123)

干细胞，包括胚胎干细胞(embryonic stem cells， ESCs)及各种成体干细胞，如间充质干细胞(mese-nchymal stem cells， MSCs)、造血干细胞(hemo-poietic stem cell, HSCs)、神经干细胞(neural stem cells， NSCs)、上皮干细胞(epithelial stem cells， ESCs)、视网膜干细胞(retina stem cells， RSCs)等，因其治疗和再生潜能受到越来越多的关注。其可能的机制是干细胞在移植后迁移到病变或损伤的部位，分化为目标细胞，修复或替换受损的细胞或组织。目前，干细胞疗法在很多疑难疾病，如帕金森病[1]、肝衰竭病[2]、修复缺血和梗死肢体组织[3]以及心肌梗死[4]等的治疗中已显现出良好的临床前效果。需要指出的是，由于缺乏对移植干细胞的在体示踪手段，干细胞移植到体内后的存活、迁移以及增殖分化过程并不清楚，导致其治疗过程尚在黑箱之中，治疗效果也很难明确界定。因此，发展有效的、适用于移植干细胞的活体示踪技术对干细胞疗法的临床推进有重要意义。

正如分子探针的发展催生了分子影像学的出现与发展一样，基于现有的医学影像设备及成像方法，适用于移植干细胞的活体示踪技术的发展将更多依赖于先进的干细胞示踪剂的开发。理想的干细胞活体示踪剂应该具备以下特点： (1) 示踪剂必须是安全的，即示踪剂不能干扰细胞的关键属性；(2) 示踪剂必须能稳定标记细胞足够时间，即示踪剂能够在干细胞的作用周期内准确指示干细胞的位置；(3) 示 踪剂能灵敏指示干细胞的活死；(4) 示踪剂能指示干细胞的增殖以及分化情况，即干细胞的功能情况。这些特点给现有医学影像技术及未来干细胞活体示踪剂的研发提出了巨大的挑战。现有的谱系示踪技术虽然能反映干细胞的活死状态，但其标记过程必须经过基因改造工程辅助，这制约了其临床转化。而其他示踪技术则普遍存在不能有效反映移植干细胞的活死以及分化和功能情况。

近年来，纳米技术和分子生物学技术的飞速发展为干细胞活体示踪技术的发展提供了新的思路。基于纳米技术制备的颗粒，如荧光量子点、超顺磁纳米粒子以及金纳米颗粒等，其纳米尺度的直径及结构赋予其稳定优异的光电子学、磁学等性能，可作为外源性标记物标记细胞，分别用于干细胞的光学成像、磁共振/磁粒子成像及光声成像等。这类具有成像功能的纳米粒子统称纳米示踪剂。纳米粒子作为示踪剂的优点除了更稳定、优异的成像性能之外，还体现在以下几个方面： (1) 可以通过控制制备方法及技术方便地调变示踪剂的成像性能，如荧光量子点的发光波长可以从紫外红移至近红外区；(2) 可 以通过耦合或修饰的方法方便地对纳米示踪剂进行功能集成，使具备多模态成像功能或者结合分子影像探针进行细胞的功能成像。已有一些探索性的工作将基于纳米颗粒的干细胞标记与其他标记技术结合，用于监测治疗过程中移植干细胞的位置、迁移、存活和分化，显示出纳米示踪剂用于干细胞治疗的巨大潜力。本文将按成像方法分类，介绍各种示踪标记技术尤其是纳米示踪剂在移植干细胞活体示踪中的应用进展，并重点关注那些可以对干细胞的活死及分化功能状态进行示踪的工作。

1 基于光学成像的干细胞活体示踪

1.1 荧光量子点结合报告基因技术示踪干细胞活死

光学成像技术是一种经典的活体成像技术，具有无创、高灵敏度、特异度、低成本等特点。基于报告基因标记技术的光学成像被较早地用于干细胞的示踪。报告基因标记需要在干细胞移植前，用携带有报告基因的质粒、反转录病毒、腺病毒或慢病毒载体转染干细胞，使细胞表达特异性酶、受体或蛋白，因为导入的基因只能在活细胞中表达，所以它的检测可以推断细胞的活性。但明显的，报告基因技术由于转染步骤的存在对干细胞损伤较大。且由于用于光学成像的报告基因一般是一些荧光蛋白[5]及荧光素酶[6]的基因，其发光区间一般落在可见光区，存在光穿透能力有限、发光寿命有限等缺陷。相比报告基因标记技术，基于纳米荧光量子点的标记技术属于外源性标记技术。成像前，通过简单的共孵育实现荧光量子点对干细胞的标记，然后被标记的干细胞移植到活体后经过激发光激发，由高灵敏度的CCD捕获发射光子，实现对干细胞的示踪。纳米量子点相比生物荧光材料具有寿命长、光学信号稳定、发光光谱范围窄并且可调等优点。但其发光仍需要外源的激发，因此也存在背景信号干扰问题，同时由于其组成为无机材料的特点，也无法直接对干细胞在活体内的活死状态进行反映。目前,有研究者将荧光素酶与量子点进行偶联,利用生物发光的自发冷光作为激发光,通过发光共振能量转移(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)方式使得量子点发射光信号。这种复合成像技术既能够利用荧光素酶特异指示细胞活性的特性,又能利用量子点优良的发光特性，还能克服其需要外源激发光的问题,是一种可高灵敏度、有效示踪干细胞分布及细胞活性的光学成像技术。Ma等[7]以荧光素酶为模板，通过生物矿化合成了Luc8-PbS近红外量子点，用该探针标记干细胞,移植活体后,注射荧光素底物,利用荧光素酶氧化底物发光激发量子点,发射具有更高组织穿透能力的近红外荧光,来对干细胞进行活体示踪。这种成像技术无需对细胞进行基因改造,目前已成功应用于胶质瘤细胞的标记和活体示踪。Huang等[8]通过将Ag2S量子点、红色萤火虫荧光素酶(RFLuc)和Ⅰ型胶原启动子驱动的荧光素酶(GLuc)结合起来，设计了一种复合纳米光学探针： Ag2S的近红外二区(NIR-Ⅱ)荧光成像有利于人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells， hMSCs)的定位，RFLuc和GLuc的生物发光成像可以分别用于实时报告hMSCs的活性和成骨分化，从而帮助了解移植的hMSCs与颅骨缺损部位的细胞外微环境之间的相互作用及干细胞促进骨再生的治疗机制。所以，基于生物发光-近红外量子点的偶联复合纳米材料有希望成为符合体内干细胞示踪要求的示踪剂结合光学成像用于临床应用。只是目前量子点的发光效率普遍偏低[9]，发光光谱需要进一步红移来改善成像深度，荧光素酶和量子点之间能量转移效率也有待提高，这些方面可能是该类探针开发将来要有所针对的努力方向。

1.2 荧光量子点结合响应性荧光分子示踪干细胞功能

借用生物传感器的设计原理，设计对干细胞死亡或分化功能关联的特异性分子响应的化学/生物显像反应结合到示踪探针上，是一种解决干细胞死活以及功能示踪的有效方法。Li等[10]制备了负载siRNA的上转换荧光@多孔氧化硅(UCNP@MSN)复合纳米粒子，用于干细胞标记和近红外光控释放siRNA。纳米颗粒中负载的siRNA释放促进了干细胞的成骨分化。此外，他们还通过对基质金属肽酶13(MMP13酶)响应的多肽将聚集诱导发光(agg-regation-induced emission, AIE)探针分子连接到复合纳米粒子表面。结果，成骨细胞特异性表达的MMP13酶通过裂解MMP13多肽触发了AIE探针的释放，从而在560 nm处产生荧光信号。因此，这类多功能复合纳米粒子探针不仅可以促进干细胞定向分化，而且可以通过光学成像监测干细胞的分化情况，为干细胞治疗及机制研究提供了新的思路。

2 基于MRI的干细胞活体示踪

2.1 报告基因技术结合MRI用于干细胞示踪

相比于光学成像,MRI具有更高的组织穿透深度和分辨率,同时又可以获得解剖和生理信息。鉴于报告基因技术的特点，结合了报告基因技术的MRI使在活体深层组织评估细胞存活、迁移和分化成为可能[11]。其原理为干细胞通过转染报告基因表达含铁的蛋白质，提供内源性MRI对比度[12]，或者在细胞内表达与外源MRI探针反应的蛋白，以增强MRI信号，从而实现对干细胞的活体示踪[13]。近年来，研究者们已经开发了几种MRI报告基因，如β-半乳糖苷酶[14]、酪氨酸酶[15]、铁基转铁蛋白受体[16]、铁蛋白[11]等，其中，铁蛋白是一种细胞内铁存储蛋白，由24个重(H)和轻(L)亚基组成，可存储和释放铁以维持铁稳态[17]。铁蛋白的过表达通过诱导转铁蛋白的表达而捕获过量的细胞内铁[18]，因此导致T2弛豫时间的明显缩短，从而通过MRI信号检出。鉴于铁蛋白的生物相容性，此技术具有干细胞活体示踪的临床应用潜力[19]。最近，Zhang等[20]采用铁蛋白作为报告基因，标记植入梗死心脏的干/祖细胞，并通过对其体内MRI信号进行定量评估，跟踪移植到心脏中干细胞的存活，生长和迁移。Lim等[21]采用携带铁蛋白MRI报告基因、荧光成像报告基因、增强型绿色荧光蛋白的慢病毒载体转染NSCs，然后将之移植到患有急性缺血性中风的大鼠健康纹状体中后，进行了双模态MRI和FLI成像，追踪移植细胞的分布和迁移长达4周。然而,MRI报告基因的成像也存在一些缺陷,如不确定在细胞死亡后铁蛋白复合物的降解速度和MRI信号的持续时间,同时活体检测的灵敏度也较低。所以在评估细胞活死的过程中仍存在一定的不确定性。

2.2 磁性纳米粒子标记结合MRI用于干细胞活体示踪

超顺磁性氧化铁纳米粒子(superparamagnetic iron oxide nanoparticles， SPIONs)是一类直径<10 nm的铁氧化物纳米颗粒或由这种纳米颗粒组成的簇状物。因为SPIONs颗粒的直径极小，每个颗粒接近单个磁畴，当对其施加外场时，整个颗粒可以沿着一个方向排列，具有很高的磁化强度；撤去外场时，热扰动又足以破坏这个排列使颗粒失去磁性，此即其所具有的超顺磁性。鉴于其颗粒直径及表面修饰策略，SPIONs一般具有很好的水溶性和稳定分散性。SPIONs中未成对电子自旋产生的局部磁场能够显著影响邻近水分子质子横向弛豫时间T2值的变化，因此是阴性增强MRI造影剂。且相对于钆基MRI信号增强剂，SPIONs具有更好的生物相容性、更高的驰豫率、可降解性、更长的体内留存时间及磁控靶向性等特点，近年来被广泛用于标记干细胞。作为一种简单有效的外源性标记策略，在动物模型上，SPIONs结合MRI已被用于ESCs[22]、BMSCs[23]、NSCs[24]等类型干细胞移植后的体内示踪。麦筱莉等[25]用聚赖氨酸修饰的SPIONs体外标记骨髓来源内皮祖细胞，并观察标记细胞移植至小鼠缺血性脑梗死模型后的迁移情况。行原位MRI并以普鲁士蓝染色辅助观察标记细胞的迁移情况。MRI结果显示，标记细胞脑内移植1周后，移植区信号改变，并沿胼胝体向病灶侧迁移，和普鲁士蓝染色结果一致。尽管如此，SPIONs外源性标记法用于干细胞的MRI示踪仍有其不足之处。如随细胞分裂，SPIONs标记信号会被稀释直至最终失去示踪作用；更关键的是，单纯SPIONs标记也不能即时反映移植干细胞的存活及功能发挥状况，所标记移植细胞已经凋亡后，仍有MRI信号被检测到，不符合干细胞体内示踪的真正要求。鉴于此，Scharf等[26]使用SPIONs和荧光蛋白双重标记BMSCs，然后跟踪其移植入肌腱损伤的大动物模型体内后的活性及增殖状况。结果证明以质量浓度为25或50 μg/mL的SPIONs标记细胞时，干细胞的标记率分别为95%和94%，且细胞活性不受明显影响；标记细胞的代谢活动和增殖能力与未标记的细胞无明显差异。MRI显示，在肌腱注射部位，第7天开始出现信号缺失。Ngen等[27]提出使用MRI双对比技术来实现对移植干细胞迁移及活/死状态的监测。他们用SPIONs[T2造影剂，铁含量为(14.8±1.7)pg/cell]和基于钆的螯合物GdDTPA[商品名： 马根维显，T1造影剂，钆含量为(3.3±0.2)pg/cell]对hMSCs进行双重标记，在活细胞中，两种造影剂都被包裹在有限的细胞空间中，彼此紧密接触，标记细胞将产生明显的T2/T2*对比度，而钆螯合物的T1对比度被湮灭。一旦细胞死亡，移植细胞的质膜就会破裂，小直径、快速扩散的钆螯合物同SPION分离，在死细胞附近产生T1增强信号。通过监测移植细胞附近T1信号的变化可以在活体中监测干细胞的活死状态。当然这种方法也有一些局限性。如GdDTPA从死细胞中释放后清除很快，所以成像时间点对于获得准确的读数非常重要。且由于钆螯合物本来就是低灵敏度的MRI显影剂，这种方法适合于造影剂会迅速积聚到可检测水平的急性细胞死亡情况。值得一提的是，此前虽然有学者对SPIONs纳米粒子在活体中长时间存在可能会释放铁离子引发一定毒性有担忧，但目前也有一些研究证实这个问题可以通过控制SPIONs剂量及在SPIONs纳米粒子表面进行一些有效修饰或者包覆来解决。

2.3 CEST造影剂结合MRI用于干细胞活体示踪

化学交换饱和转移(chemical exchange satu-ration transfer， CEST)是一种新型MRI技术，与一般意义MRI增强剂基于改变水质子弛豫时间不同，CEST造影剂基于自身被激发饱和的质子与周围游离水中未被饱和的质子间化学位移不同而发生交换，引起磁共振信号改变来产生对比图像的。由于质子间的交换速率与组织微环境的pH值之间存在直接联系，因而可以通过CEST-MRI信号间接对活体组织进行pH值成像。关键的是，CEST造影剂可以是外源性小分子和金属螯合物，也可以是内源性蛋白质、多肽、葡萄糖或多糖分子，因而有更好的生物相容性。由于细胞的生理状态(病理或者死亡)会引起细胞内及微环境pH值的变化,通过开发合适的CEST造影剂，CEST-MRI可被用于示踪移植干细胞的生理状态。Chan等[28]报道了一种基于多聚L-精氨酸(具有多个可交换NH质子的分子)的pH值敏感型CEST造影剂，用于在体监测移植肝细胞的存活状况。他们将聚精氨酸做成纳米脂质体，然后跟移植细胞封装在藻酸盐凝胶微球中,整体移植到肝脏组织中。微球中移植细胞死亡会引起pH值从正常的7.3左右下降到6.0左右,纳米脂质体CEST试剂中精氨酸发生质子交换的速率对这个pH值变化敏感而随之下降，产生可被检测的CEST-MRI信号，从而可以利用MRI系统即时实现对移植细胞的活性检测。此示踪平台的优势在于能够将移植细胞的生存信号与高分辨解剖学成像信息结合起来,生物相容性好，有较好的临床转化潜能。但其不足之处在于并不能很好地反映移植后细胞的增殖过程。研究则将报告基因技术和CEST-MRI技术结合起来，将单纯疱疹病毒-1型胸苷激酶(HSV1-tk)报告基因标记的MSCs与CEST-MRI探针5-methyl-5,6-dihydrothymidine(5-MDHT)共培养，然后移植到猪的心脏组织中，利用CXCL12对HSV1-tk基因表达的驱动作用及HSV1-tk对5-MDHT探针分子的召集作用这条关系链，通过CEST-MRI间接反映干细胞分泌CXCL12促进心肌修复的情况，巧妙地用CEST-MRI技术示踪了移植干细胞的活死及功能状况[29]。此项示踪技术若结合前面Chan等[28]的纳米脂质体技术，将获得更好的成像分辨率，具有好的在体干细胞示踪临床应用价值。

3 基于超声成像的干细胞活体示踪

超声成像(ultrasound imaging， US)技术利用探头发射超声波于组织上并接收回波数据来成像，由于不同组织的声阻抗和衰减特性有差异，经过不同组织的回波强度就产生了对比差异，因而成像能反映组织结构。US几乎无创且有良好的时空分辨率和较好的组织穿透深度，是可用于干细胞的活体示踪的影像技术[30]。超声造影剂是在US中用来增强图像对比度的物质。一般为微米级直径的包膜微气泡，通过静脉注射进入血管后，可以改变组织的超声特性(如背向散射系数、衰减系数、声速及非线性效应)产生造影效果，其增强效果取决于超声造影剂的浓度、直径以及超声发射频率。1984年，Feinstein等[31]发明了白蛋白包裹气泡形成的超声造影剂，此后基于气泡的超声造影剂研究得以快速发展。这类超声造影剂一般在空气气泡周围包裹白蛋白、脂类或多糖等，作为膜稳定剂。最近20年，新型的气泡型超声造影剂气体多为由氟碳类低弥散度、大相对分子质量的气体，气泡的直径也更小，即微泡超声造影剂。微泡的直径一般约几微米，由一层厚度为几十纳米的膜包裹，膜的弹性及韧性也有所改进，稳定性得以提高，可直接标记干细胞[32]。但微泡造影剂始终还是因为直径大(相对细胞而言)、气泡寿命短等问题不能很好地适用于干细胞的稳定示踪。这种情况下，基于刚性纳米材料的超声造影剂出现了。刚性颗粒和组织界面的声阻抗差别较大使得纳米颗粒可以显著增强标记干细胞的US信号。重要的是，与传统的基于脂质或蛋白质气泡的US造影剂相比，刚性纳米粒子在长期和稳定地进行干细胞追踪方面显示出更大的优势。Jokerst等[33]发现通过笼蛋白和肌动蛋白内吞，二氧化硅纳米颗粒(300 nm)可以用来标记hMSCs显著增强US信号(大约是未标记细胞的7倍)。US的检测下限为70 000个细胞，大大低于基于钆标记的MRI的检测限(250 000个细胞)，表明US具有更高的灵敏度，有助于提高干细胞移植治疗的精准性。Chen等[34]报道了一种具有凹面介孔结构类外泌体形貌的二氧化硅纳米颗粒(exosome-like silica， ELS)。这些ELS纳米颗粒的凹面介孔结构对超声波具有“多重散射/反射”效应，从而能够显著提高其回声能力，使之成为性能优异的US造影剂。颗粒合成中引入的TSPA(一种含有胺基的硅源)，不仅利于外泌体形貌的形成，而且使ELS表面带有正电荷，增强了其与干细胞的亲和力。ELS纳米颗粒标记干细胞后，可以通过US实时跟踪监测移植干细胞。当然，ELS纳米颗粒因其多孔的特性，还可以负载细胞因子等，从而提高移植干细胞的存活率[35]。此外，这些ELS颗粒很容易被化学修饰，可以在表面连接放射性核素或钆离子，成为多模态示踪剂。总之，硅基纳米粒子因其良好的生物安全性和可设计的多孔特性，跟超声造影技术结合后，有潜力成为干细胞活体示踪向临床转化的示踪剂。今后可通过多孔结构设计及表面改性进一步提高硅基纳米粒子的干细胞标记及US示踪能力。

4 基于光声成像的干细胞活体示踪

光声成像(photoacoustic imaging， PAI)的原理基于光声效应： 近红外激光以脉冲(1～100 ns)形式照射到目标介质/组织上，介质吸收光后产生热弹性膨胀，能量以机械波的形式释放,即光声信号。光声信号携带了介质的光吸收特征信息，通过探测光声信号能重建出介质各部分的光吸收分布图像。因此，光声成像结合了纯光学成像的高选择性和纯超声成像的深穿透优点，可得到高分辨率和高对比度的组织图像，从原理上避开了光散射的影响，突破了高分辨率光学成像深度“软极限”。PAI的成像设备易于操作，能够以实时和非侵入性方式提供功能和解剖信息[36]。考虑到光声转化效率，几种在近红外波长有强吸收的小分子染料，如FDA批准的ICG和其他近红外花箐染料被用于PAI，但它们存在易光漂白和水溶性较差的问题[37]。为了解决这些问题，各种基于纳米粒子的PAI探针已在动物模型上用于示踪移植细胞[38]。Kim等[39]用聚赖氨酸(poly-L-lysine, PLL)修饰的普鲁士蓝纳米粒子(Prussian blue nanoparticles-PLL, PB-PLL)有效标记了hMSCs。PB-PLL纳米粒子在730 nm光激发下有很强的PAI信号，能够对小鼠脑中hMSCs的移植过程进行长达14 d的成像示踪。此外，PB-PLL标记的hMSCs在小鼠模型上的检测限为200 cells/μL，低于二氧化硅包裹的金纳米棒的检测限(约1 300 cells/μL)。此方法可定量评估到达靶点的细胞数量，但仍不能反映其植入后的存活状态。为解决这个问题，Dhada等[40]通过将金纳米棒与对活性氧类(ROS)敏感的染料IR775c相结合，开发了一种基于纳米颗粒的复合PAI造影剂，标记干细胞并追踪其活性。在该体系中，IR775c在795 nm处的PAI信号随介质中活性氧浓度的增加呈线性下降，而金纳米棒在920 nm处保持成像稳定性，与ROS浓度无关。因此，通过对795 nm和920 nm两处信号进行定量比较，可以获得移植MSCs的即时活性。总体而言，随着PAI系统和基于纳米颗粒的PAI造影剂的发展，使用实时PAI对移植干细胞进行准确和非侵入性检测可以提高其治疗效果，从而推动干细胞治疗的发展。

5 基于多模态成像技术的干细胞活体示踪

鉴于现有的示踪技术(包括影像技术及造影剂)都各有其优势和缺点，没有一种完全满足前面提到的干细胞活体示踪的所有要求。如谱系示踪/报告基因技术结合光学成像虽然成熟且属于极少的能实时体现干细胞活死状态并能抗传代稀释的技术之一，但该技术使用前提是对细胞进行基因转染，因此不满足干细胞活体示踪的安全性要求。且光学成像技术空间分辨率及成像深度也非常有限。而多模态示踪将不同的造影技术联合使用，使不同成像技术形成优势互补，不同来源的成像信息相互印证补充。尤其当示踪剂本身可以集成多种成像功能时，用于细胞标记可以使研究结果更为精确可信和全面，有望最终达到干细胞活体示踪的要求。目前多模态成像用于示踪干细胞活死状态及功能的工作并不多，下面就列举一些有代表性的工作。

5.1 PET结合MRI

如上文所述，因MRI增强造影剂超顺磁氧化铁纳米粒子低毒、高灵敏度、磁控靶向性以及MRI成像大的穿透深度和高分辨率的特点，基于SPIONs的MRI仍然是目前干细胞示踪研究的主要对象之一[41]。而基于SPIONs的MRI不能满足的方面，如，对干细胞活性及功能的示踪，可以由其他示踪手段来互补。正电子发射断层显像(positron emi-ssion tomography， PET)是一种先进的临床核医学检测技术，是唯一可在活体上显示生物分子代谢、受体及神经介质活动的新型影像技术。其成像原理： 将生物生命代谢中必需的物质，如葡萄糖、蛋白质、核酸、脂肪酸等标记上短寿命的放射性核素(18F、11C等)，并作为造影剂注入活体，然后通过跟踪造影剂的代谢过程及分布，来反映组织和器官的功能情况。如以18F标记的脱氧葡萄糖为PET造影剂时，根据大部分恶性肿瘤组织中葡萄糖代谢旺盛、聚集较多的特点，PET能通过图像对早期的肿瘤病变进行诊断[42]。但PET成像缺乏解剖学信息，且其较低的空间分辨率会使细胞的准确定位变得困难；此外，所应用的示踪剂半衰期有限，限制了它们作为长期细胞示踪剂的使用[43]。PET和MRI双模态造影不仅可以提供具有高软组织对比度的解剖学信息，还可以对组织中标记的移植细胞进行高灵敏度成像及特定功能示踪。有研究开发了18F标记的Fe3O4@Al(OH)3纳米颗粒作为安全细胞示踪剂在PET-MRI双模态同步成像中的应用： 早期使用PET快速、简便地定位和量化纳米粒子及标记干细胞MSCs，而MRI则提供高分辨率的解剖学信息和长期跟踪[44]。Higuchi等[45]对人内皮祖细胞分别进行了碘钠转运基因和氧化铁纳米粒子标记，以通过124I-PET和MRI结合显像，对移植的HEPC的定位、存活以及心脏的形态学信息进行示踪。报告基因的表达提供关于存活细胞数量的特异性信息，铁氧体纳米粒子标记提供组织形态学信息，此双模态方法可对细胞定位和活性进行互补分析。

5.2 光学成像结合MRI

用于光学成像的荧光标记技术结合SPIONs-MRI的多模态成像也可用于移植干细胞的活体示踪。Lim等[46]制备了含有SPIONs和近红外荧光染料Cy5.5的壳聚糖复合纳米粒子探针标记MSCs，以实现近红外荧光-T2加权MRI双模成像引导的细胞示踪。首先他们用四乙酰化的N-叠氮乙酰-d-甘露糖胺(Ac4ManNAz)处理hMSCs，通过糖工程在其表面生成叠氮(-N3)基团。然后，通过体外点击化学方法对细胞表面进行复合纳米探针标记。与单一纳米粒子标记技术相比，这种复合标记方法可大大提高细胞标记的效率、安全性和成像灵敏度。在中风小鼠模型中，经脑实质内注射复合标记的hMSCs，采用双模成像引导进行精确追踪，实现了对标记hMSCs从植入部位到脑卒中病变为期14 d的迁移追踪。研究开发了一种基于商用SPIONs Feru-moxytol和响应Caspase-3释放荧光的复合纳米粒成像探针，用于干细胞的MRI和响应荧光成像[47]。基于Ferumoxytol的MRI可以实时观察干细胞移植到小鼠颅骨缺损后的空间分布；Caspase-3响应荧光基团则有助于检测移植后因早期免疫排斥引起的干细胞死亡。这种双模态成像示踪有助对干细胞治疗过程进行及时的矫正干预。

6 干细胞示踪的挑战和未来

综上，基于纳米材料独特的纳米尺度效应(如超顺磁性)、纳米集成效应(可以修饰各种功能分子、偶联其他成像模态的分子)，好的成像灵敏度、结构和化学稳定性以及标记效率等方面的优势，纳米示踪剂结合各种成像方式已在移植干细胞的活体示踪，尤其是最具挑战性，也是最关键的干细胞活死示踪及迁移、分化功能示踪上取得了一些进展。治疗的动物模型也涉及了中风、心肌梗死、骨损伤及神经系统损伤等疾病。基于这些工作，人们对移植干细胞在体的命运转归已有初步了解，也发现了一些重要问题，如存活时间短、定植率低等。但跟干细胞治疗机制更相关的干细胞在体分化、增殖及功能发挥等情况却远远不够明确。而且目前没有一种基于纳米材料的干细胞示踪剂获得FDA的批准。所以，一方面干细胞示踪剂的研发有迫切的临床需求，另一方面纳米示踪剂要真正转化为临床所用，还面临很多挑战。

首先，作为外源性标记物，无论是用于光学、MRI还是PET成像的纳米示踪剂都未能克服随细胞传代而浓度被逐渐稀释的问题。移植干细胞在体内增殖分化后，标记上去的纳米示踪剂会随着干细胞的增殖或细胞胞吐而逐渐被稀释，最终达不到成像需要的浓度而失去示踪能力。其次，除部分商品化的SPIONs，目前对各种纳米示踪剂生物安全性的研究仅限于体外及动物实验。标记有纳米示踪剂的移植干细胞在生物体中的代谢途径、生物分布和长时间生物效应还没有得到系统的研究。因此，就生物安全性这方面，纳米示踪剂离临床应用也有较长的路要走。最后，对于确定成分的示踪材料，其颗粒大小、形貌、表面性质等都会影响其标记效率、细胞毒性、降解率和在体内的存留时间。因此在设计纳米示踪剂时，为了获得更好的生物相容性和标记、示踪能力，需要更全面深入地考虑纳米粒子合成策略及表面改性策略，然后再对其示踪能力及生物效应作相应评估和定论。

按照文章开头提出的移植干细胞活体示踪要求，干细胞示踪剂的未来发展应该在以下方面： (1) 多 模态示踪仍然是必然趋势。鉴于干细胞活体示踪对细胞存活、增殖、分化、迁移各方面的要求，只有将各种标记技术/成像模式结合起来取长补短才有可能部分或全部满足这些要求。如虽然报告基因标记技术对干细胞的影响一直都饱受诟病，但目前只有这种标记技术能抗传代稀释且同时能反映细胞的存活状况。鉴于目前基因转染技术也在不断改进提高其安全性和转染/表达效率,未来基于报告基因标记技术的多模态示踪必然还是很多研究者选择的研究方向。MRI的安全性、高软组织分辨率及深度优势也是别的成像模式无法替代的，基于CEST成像原理的MRI示踪剂因其更好的生物安全性及细胞微环境pH值示踪能力而值得采用。(2) 设 计基于生物传感原理的响应型示踪剂很有必要。移植干细胞的死亡或正常分化必然伴随一些特异性分子的释放，只要找到了可对这些分子响应的化学/生物显像反应并结合到示踪探针上，便会成为解决干细胞死活以及功能示踪的有效方法。而生物传感器在过去几十年的发展中已经积累了丰富的对待测分子响应的化学/生物检测原理可以供干细胞示踪剂的设计借用，如基于对Caspase-3响应发光的策略可以报告干细胞的死亡。(3) 基于纳米集成策略设计多功能示踪平台也是有必要的。从现有研究来看，移植干细胞在体内存活时间仍然较短，定植及分化效率较低，因此，赋予纳米示踪剂磁性，利用外磁场帮助干细胞在靶部位定植，以及在纳米示踪剂中引入合适的生长因子和其他生物活性物质以增强被标记干细胞活性、定向分化和迁移都是在设计新型多功能示踪平台时值得考虑的策略。