肿瘤相关巨噬细胞促肝细胞癌发展的研究

邓银芝，罗和生

武汉大学人民医院消化内科，湖北 武汉 430060

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球第六大常见的癌症，每年导致80多万人死亡，在与癌症相关死亡人数中排名第三[1]。在中国，促进肝癌发展的主要原因是乙型肝炎病毒(HBV)感染、丙型肝炎病毒(HCV)感染、慢性酒精性肝炎等[2]。慢性炎症引起肝组织不可逆转的损伤，并最终发展为肝硬化和肝癌[3]。

巨噬细胞是单核细胞系的分化细胞，在不同的微环境中，表现为功能不同的亚型，主要为M1型和M2型。M1型是巨噬细胞的经典活化途径，该途径主要受IL-12、IL-23、一氧化氮(NO)、干扰素-γ的调节，主要起抗原呈递作用，发挥抗原杀伤及肿瘤抑制功能；M2型是巨噬细胞的替代活化途径，主要由IL-4、IL-10、IL-13、TGF-β这些抗炎介质激活，抑制炎症反应、促血管生成、组织重塑、免疫耐受和肿瘤进展[4-5]。肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)是指在肿瘤微环境中，巨噬细胞在相关趋化因子的作用下聚集到肿瘤组织周边并发生特定性分化的一类巨噬细胞[6]。TAMs主要表现为M2型，M2型TAMs具有促肿瘤生长和转移作用，M1型TAMs具有抗肿瘤和增强免疫作用[7]。M2型TAMs在肿瘤的发生、转移和免疫逃逸中发挥非常重要的作用[8-9]。Kupffer细胞是存在肝组织中的巨噬细胞的一种特殊亚型，促进肿瘤进展[10-11]，被认为是HCC特异性TAMs。目前已知TAMs促肝癌细胞增殖、血管生成、恶化转移，多预后不良。而TAMs在HCC中的促肿瘤作用机制复杂且对其知之尚少，现已知相关通路包括Wnt/β-catenin信号通路、集落刺激因子-1(CSF-1)及其受体CSF-1R、STAT3信号通路等。TAMs与肝癌细胞的作用机制复杂，并促进HCC发展，导致临床预后差。系统地研究TAMs与肝癌细胞之间作用的机制，希望为HCC的进展和治疗的研究提供新的思路。

1 TAMs促HCC发展

1.1 TAMs与肿瘤微环境巨噬细胞、T淋巴细胞、自然杀伤细胞(NK细胞)、中性粒细胞、树突状细胞和骨髓源性抑制细胞(MDSCs)等主要免疫细胞组成了肿瘤免疫微环境[12]。TAMs和调节性T细胞(Treg)是两种主要的免疫抑制细胞类型，具有促肿瘤生长作用。TAMs表达的趋化因子如CCL5、CCL22、CCL20和细胞因子如IL-10、TGF-β可诱导Treg细胞。TAMs分泌的趋化因子和细胞因子参与免疫抑制性肿瘤微环境(immunosuppressive tumor microenvironment，ITM)。TAMs可与MDSCs、肿瘤相关树突状细胞和中性粒细胞协同促进ITM的生成。另外，TAMs还可抑制肿瘤浸润T细胞和NK细胞的抗肿瘤作用。研究表明，在小鼠HCC模型中，CA1P(一种微管聚合抑制剂，与微管蛋白的秋水仙碱结合位点结合)可以清除TAMs和Treg，改变了肿瘤微环境(the tumor microenvironment，TME)，同时降低转化生长因子-β(TGF-β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的表达，诱导肝癌细胞凋亡而发挥显著的抗肝癌作用[13]。另Bartneck等研究发现，人类患者和小鼠的HCC微环境以功能不同的巨噬细胞群为特征，其中CCR2+炎性TAM亚群具有促血管生成特性；人CCR2+TAMs在肝癌高血管化边界聚集并表达炎症标志物S100A9，而CD163(+)免疫抑制TAMs在肝癌中心聚集；在肝纤维化-HCC小鼠模型中，CCR2+TAMs明显表现出促炎和血管生成活性，在肝纤维化-HCC模型中使用药物趋化因子CCL2拮抗剂抑制CCR2+TAM细胞浸润，显著降低了病理血管化和肝血容量，同时降低了肿瘤体积[14]。并有研究显示，肝癌微环境可诱导TAMs中Nogo-B的表达上调，促进巨噬细胞的M2型极化，从而促进了肝癌的发展[15]。可知，在HCC的微环境中，TAMs是促肝癌细胞进展的主要免疫细胞之一，常在肿瘤进展的各个阶段发挥作用。

1.2 TAMs促转移TAMs可释放多种炎症因子、趋化因子和生长因子促肿瘤的进展和转移，在促肿瘤转移中有着重要的作用。由于恶性肿瘤的快速生长，肿瘤内部会有一个缺氧区，缺氧是恶性肿瘤的一个标志[16]。据研究，在低氧微环境中，肝癌细胞坏死碎片可诱导具有M2型TAMs有效释放IL-1β，IL-1β使环氧合酶-2(COX-2)上调缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的合成，过表达HIF-1α可促进肝癌细胞转移[17]。低氧环境还促进了肝血管生成因子(HIF-1α和VEGF)的表达，并可能促进了KC和TAMs的极化，促肝癌的进展[18]。另外，缺氧条件下HCC高迁移率组蛋白box1(HMGB1)表达增强，诱导巨噬细胞IL-6的表达增强，进而促巨噬细胞浸润及HCC转移[19]。另有研究显示，HCC的瘤旁肝组织中HMGB1的高表达可能与瘤旁TAM浸润有关，促肿瘤进展和转移[20]。在低氧微环境中，肝癌细胞和TAMs相互作用，促进HCC进展和转移。

1.3 TAMs与肿瘤干细胞(CSCs)众所周知，CSCs驱动肿瘤的发生和发展，对于远处新肿瘤的生长也是必需的。Wan等研究发现，CD44是HCC CSCs的一个重要标志物，CD44+CSCs可通过人HCC TAMs分泌IL-6和激活HCC细胞中的STAT3信号促CSCs的扩增和肿瘤发生，人HCC标本中IL-6水平与肿瘤分期和CSCs标志物相关[21]。另有研究表明，在HCC中，TAMs通过TGF-β1诱导EMT，促进CSCs样特性，并有助于HCC的进展[22]。这些研究说明CSCs与TAMs可能互相影响，具有协同作用，促进HCC进展。

2 TAMS调控HCC进展的相关信号通路

2.1 CSF-1/CSF-1RCSF-1及其受体CSF-1R调控巨噬细胞的分化及功能，促巨噬细胞的浸润和HCC的进展。研究表明，CSF-1刺激巨噬细胞表达的同种异体移植炎症因子1(AIF1)诱导巨噬细胞呈M2样表型，肝癌细胞分泌的CSF-1通过促进c-Jun与同AIF1启动子的结合，通过CSF-1-MEK1/2-ERK1/2-c-Jun轴提高AIF1表达，巨噬细胞中表达的AIF1促进了RAW264.7和Hepa1-6共培养体系中肝癌细胞的迁移和动物模型中肿瘤的生长[23]。另有研究显示，CSF-1R阻滞通过改变肝癌中TAMs的极化，从M2向M1的转变，来延缓肿瘤的生长，而不是消耗TAMs来延缓肿瘤生长；使用CSF-1R抑制剂PLX3397阻断CSF-1R，改变瘤内微环境，促进巨噬细胞的极化转变为M1，HepG2和HCCLM3(两种人肝癌细胞株)证实了这种肿瘤抑制现象[24]。另外，Zhu等研究发现，肿瘤细胞内源性骨桥蛋白(OPN)促进趋化迁移和替代活化巨噬细胞，并通过活化巨噬细胞CSF-1-CSF-1R通路促进PD-L1在HCC中的表达，联合抗PD-L1和CSF-1R抑制可激发有效的抗肿瘤活性，延长OPN(高)荷瘤小鼠的生存时间[25]。可知，在HCC中，CSF-1及CSF-1R可通过促TAMs M2极化，导致肿瘤的生长迁移，而CSF-1R阻滞可改变瘤内环境，达到抗肿瘤目的。

2.2 STAT3信号通路STAT3被认为是细胞周期或细胞存活相关基因的关键转录激活因子，在人类HCC中，STAT3磷酸化已被检测到，并且与肿瘤发生和肿瘤进展、血管生成有关。通常，M2型TAMs通过IL-6/STAT3信号通路影响肝癌细胞，具有促增殖、抗凋亡和抑迁移的作用[26]。并且TAMs分泌IL-6，可经STAT3信号通路促进人肝癌CSCs的扩增和肿瘤发生[21]。Toll样受体4(TLR4)也是肿瘤侵袭性和预后不良的分子生物标志物，研究表明M2极化的TAMs可能参与TLR4/STAT3信号通路促进肝癌细胞迁移和EMT[27]。另有研究发现，在HCC组织，TAMs中SIRT4表达明显下调，通过FAO-PPARδ-STAT3轴促进TAMs型M2极化，促进了肝癌细胞的体内外生长[28]。

2.3 Wnt信号通路Wnt/β-catenin通路也可促TAMs的M2极化。研究显示，肿瘤细胞来源的Wnt配体经典型的信号通路刺激TAMs呈M2样表型；并检测到M2型TAMs中β-catenin、c-Myc和Axin2增加，Wnt/β-catenin信号通路又通过c-Myc促进M2极化[29]。在SMMC-7721肝癌细胞中，来自M2型TAMs的TNF-α，经Wnt/β-catenin促进EMT和癌细胞具有CSCs特性，促进HCC进展[30]。另有研究报道，骨髓特异性NOTCH通路被重组信号结合蛋白Jκ(RBPjcKO)阻断，加速了原位接种的小鼠肝Hepa1-6肿瘤的生长；并在患者源性肝癌活检中，CD68+巨噬细胞中NOTCH信号与Wnt激活呈负相关，而Wnt激活与HCC晚期呈正相关；NOTCH阻断上调Wnt/β-catenin，促进HCC TAMs增殖和原细胞因子产生，促进HCC进展和结直肠癌的肝转移[31]。由上可知，肿瘤细胞来源的Wnt配体通过典型的信号通路刺激TAMs的M2极化，从而导致HCC中肿瘤的生长、迁移、转移和免疫抑制。

2.4 其他信号通路在HCC中，神经紧张素(NTS)诱导IL-8可能通过MAPK和NF-κB通路诱导TAMs的M2极化和肝癌细胞的EMT，并促进EMT和HCC侵袭[32]。巨噬细胞中的Nogo-B可显著增强IL-4介导的M2型巨噬细胞中Yap和Taz的表达，Nogo-B通过增强Yap/Taz介导的TAMs M2极化促进了HCC的进展[33]。另有研究表明，脂肪酸氧化(FAO)有助于M2型TAMs分泌IL-1，促进M2型TAMs介导的肝癌细胞增殖、迁移和侵袭[34]。据报道，CCL2/CCR2轴主要是将单核细胞吸引到组织内，并协助进一步极化巨噬细胞，从而促进肝细胞的癌变[35]。另研究发现，在HCC中，内皮素阳性的癌相关成纤维细胞(CAFs)可以通过与CD68的相互作用招募巨噬细胞，内皮素可以通过调节GAS6的表达和分泌促进巨噬细胞的M2极化，从而促进HCC的进展[36]。

TAMs在HCC中的促肿瘤作用是通过复杂的信号通路介导的，这些信号通路可能直接作用于肝癌细胞，也可能通过抑制其他免疫细胞等来作用于肝癌细胞。众所周知，氧化硝基结构域含蛋白1(NOR1)是一个肿瘤抑制基因，在HCC相关TAMs中过表达，并促进M2交替极化。NOR1在小鼠中的基因缺失导致IL-6减少和NF-κB激活受损，进而减弱了因子诱导的HCC的发展[37]。在HCC中，miR-98通过调节IL-10抑制TAMs，可能抑制了肝癌细胞的进展[38]。研究表明，在肝癌TAMs中GAS5表达下调，而TAMs过表达GAS5可促进TAMs向M1型极化，M2极化受抑制，进而延缓HCC的进展[39]。有研究进一步表明，GAS5过表达可通过上调PTEN表达抑制TAMs的M2样极化，从而抑制人肝癌细胞系(SMCC-7721)细胞的增殖和侵袭[40]。另有研究显示，miR-125a/b通过靶向CD90(HCC干细胞的干细胞标志物)抑制肝癌CSCs介导的TAMs，抑制细胞增殖和干细胞特性[41]。

3 结语与展望

以上研究表明，TAMs通过相关信号通路促进肝癌免疫抑制的微环境、肝癌发生、血管生成，促进肝癌的进展，也可通过抑制相关免疫细胞而发挥抗肝癌作用。在肝癌细胞的进展中，TAMs有着重要的作用，TAMs也可作为预后不良的生物标志物。TAMs促肝癌细胞进展机制复杂，另外有学者提出“肝癌细胞与巨噬细胞间正反馈环”概念[42]，TAMs与肝癌细胞相互作用机制有待进一步研究。近年来，许多研究人员将注意力集中在与TAMs相关的癌症免疫治疗，及通过调控TAMs来控制HCC的进展。研究表明，TAMs表达的趋化因子CXCL9可调节表达CXCR3的干细胞样CD8 T细胞的招募和定位，而这些干细胞是抗PD-L1治疗的临床反应的基础[43]。近来有研究报道，抗肿瘤药物瑞格非尼可抑制TAMs P38激酶磷酸化及下游Creb1/Klf4活性而逆转TAMs M2极化，增强抗肿瘤免疫[44]。TAMs在肿瘤免疫抑制中起着重要作用，靶向TAMs M2表型的减弱或逆转为HCC的免疫治疗提供了新的思路[45]。TAMs作为HCC靶向治疗的研究热点，有望成为HCC治疗的新靶点，阐明TAMs与HCC发生发展关系及其具体相关作用机制，为TAMs作为HCC治疗的潜在靶点提供更多理论依据，有助于促进HCC发展的研究和HCC治疗的进一步研发，以期为HCC的临床治疗提供更多有效参考。