竞争性内源RNA在肝细胞癌发生发展中的作用

陈晓昊， 邓益斌

1 广西肝胆疾病临床医学研究中心， 广西 百色 533000； 2 右江民族医学院附属医院 检验科， 广西 百色 533000

肝细胞癌(以下简称肝癌)是世界范围内肿瘤致死的主要原因之一。根据《中国肿瘤登记年报》的数据，肝癌是我国第五大常见的癌症，也是导致癌症相关性死亡的第二大疾病。肝癌的发生是一个多步骤过程的结果，涉及多个基因表达谱和细胞内信号通路改变，但其确切的发病机制尚不清楚[1]。尽管最近几年在肝癌的临床诊断和治疗方面有了进展，但肝癌患者的总生存时间并未得到有效改善，其5年生存率仍然很低。这主要是由于手术后肿瘤复发率高和远处转移。因此，不断深入研究肝癌的详细发病机制，寻找早期分子诊断标志物，确定新的治疗靶点对于预防和治疗有重要意义，也是当前肝癌领域研究热点。

近年来，随着二代测序技术的进一步发展和对肿瘤发病机制的深入研究，大量文献报道了非编码RNA参与肿瘤相关基因的表达调控。竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs，ceRNA)调控网络假说也在2011年被Salmena等[2]首次提出。ceRNA假说展现了一种RNA间互作的全新机制，是一种全新的基因表达调控模式，与微小RNA(miRNA)调控网络相比，ceRNA调控网络更加精细和复杂，涉及了更多RNA分子，为科研人员提供了一个全新进行转录组研究的视角，有助于更全面、更深入地解释一些生物学现象。本文综述ceRNA调控网络在肝癌中的研究进展。

1 ceRNA及其调控机制概述

1.1 ceRNA ceRNA不是一类全新的RNA分子，而是可以与其他RNA分子竞争性结合miRNA的一大类RNA的统称。其主要包括，人工miRNA海绵(artificial miRNA sponges)、假基因(pseudogene RNAs)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circRNA) 和信使RNA(mRNA)[3]。

1.2 ceRNA网络调控机制概述 ceRNA调控网络中的关键节点是miRNA。miRNA是一类长度在19～25个核苷酸长度的非编码RNA，在ceRNA网络中其主要作用是将miRNA介导的沉默复合物引导至miRNA响应元件，进而抑制翻译过程或使mRNA降解从而调节蛋白质的产生。简言之，miRNA可以通过结合mRNA使基因沉默，而ceRNA，包括lncRNA和circRNA等，可以通过竞争性地结合miRNA来调节基因表达。miRNA响应元件一般位于mRNA和非蛋白质编码转录本(如假基因和lncRNA)的3′非翻译区(UTR)，编码序列和5′UTR上。由于一个miRNA具有许多RNA靶标，而绝大多数RNA分子又带有多个miRNA响应元件，因此通过作用于不同的miRNA响应元件，一个miRNA可以靶向调节成百上千个靶基因；同样的，一个蛋白靶基因可以受到多个miRNA同时调控[4]。正是由于这种广泛存在的靶标多样性，ceRNA调控网络假说在2011年被正式提出，即具有共享miRNA结合位点的非编码转录本与mRNA竞争结合相关miRNA，进而转录后基因的表达[5]。

2 ceRNA与肝癌

现有研究表明，多种RNA作为ceRNA参与肝癌增殖、转移侵袭、血管生成等多种生物学活动。本文将从ceRNA分类的角度，综述各类ceRNA在肝癌发生、发展过程中的功能。

2.1 mRNA作为ceRNA在肝癌中的作用 mRNA是编码基因转录加工的中间产物，由于多个mRNA可含有同种miRNA响应元件，则有同种miRNA结合位点的mRNA间可以通过竞争性结合到miRNA而互为ceRNA。CD151作为一种已知的致癌蛋白，可参与多种癌症发生发展过程中的转移、侵袭和肿瘤新生血管形成。此外，CD151在肝癌的上皮间充质转化中发挥重要作用，其mRNA的3′UTR中含有miRNA响应元件，受到肿瘤抑制性miR-124调控。PIK3C2 mRNA和LAMC1 mRNA可通过螯合miR-124促进CD151的表达，发挥ceRNA作用[6-7]。此外，Fas是受到深入研究的可引起细胞凋亡的膜受体。Zhang等[8]研究报道了STARD13 mRNA可通过竞争性结合miR-340、miR-448、miR-374、miR-203、let-7、miR-216b、miR-316、miR-23、miR-153，作为Fas的ceRNA促进肝癌凋亡。

2.2 lncRNA作为ceRNA在肝癌中的作用 lncRNA是长度超过200个核苷酸的非编码RNA家族，有大量文献报道其在人类各种疾病中具有重要作用。在肝癌相关的ceRNA网络中，lncRNA作为ceRNA的研究最多，lncRNA与肝癌细胞的增殖、凋亡、血管生成、侵袭转移及预后密切相关，其作为ceRNA参与了肝癌发生发展的多种生物学过程[9]。

Lnc-SNHGs是长链非编码小核RNA宿主基因家族，在多种癌症中异常表达并发挥重要作用[10]。Zhang等[11]研究发现了lncRNA SNHG3作为ceRNA参与 miR-128调控CD151基因在肝癌中的分子作用。他们首先通过生物信息学发现miR-128为SNHG3的潜在靶点且其在CD151的3′UTR中有一个结合位点，并利用荧光素酶实验进一步验证miR-128可以抑制CD151基因的荧光素酶活性。最终研究发现lncRNA SNHG3通过与miR-128竞争性结合来抑制CD151 mRNA的降解，上调 CD151 靶基因表达，参与调节肝癌细胞的侵袭和上皮间充质转化。除SNHG3外，SNHG1、SNHG5、SNHG8、SNHG12等均与不同分子构成ceRNA网络参与到肝癌的发生发展过程[12-15]。

Li等[16]研究发现lncRNA TP73-AS1在肝癌组织和细胞系中高表达，而其表达量降低时可抑制肝癌细胞的增殖以及HMGB1、RAGE和NF-κB的表达水平。HMGB1是参与调控细胞死亡的关键因子。既往研究[17]表明，利用HMGB1 DNA增强内源性HMGB1的表达，可增强肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。HMGB1在肝癌细胞系中激活RAGE信号通路，诱导NF-κB激活，促进细胞增殖、侵袭和转移。敲除TP73-AS1后，miR-200a的表达量升高，且miR-200a可以负调控肝癌细胞系中HMGB1、RAGE和NF-κB的表达，对肝脏起到保护作用。由此可见，lncRNA TP73-AS1通过与miR-200a相互作用调节HMGB1/RAGE来促进肝癌细胞的增殖。LncRNA TP73-AS1可能是调节肝癌细胞增殖的关键分子，并可以为肝癌的治疗提供潜在的治疗靶点。

YWHAZ是许多信号通路的中心枢纽蛋白，主要参与细胞凋亡、细胞周期调控、信号转导、细胞黏附和蛋白招募等生物学过程，在包括肝癌在内的许多恶性肿瘤中起着癌基因的作用[18-19]。LncRNA MIR4435-2HG(即lncRNA-AWPPH，MIR4435-1HG，LINC00978，MORRBID和AGD2)可作为不同分子的ceRNA参与到结直肠癌、三阴性乳腺癌、骨肉瘤、肺癌、胃癌的产生和发展[20-24]。而近年来又发现MIR4435-2HG在肝癌中也可以发挥重要作用，其含有miR-22-3p的结合位点，可以通过使miR-22-3p海绵化而消除miR-22-3p对YWHAZ的作用，从而促进YWHAZ的表达。即MIR4435-2HG通过调节miR-22-3p/YWHAZ途径在肝癌中发挥其促增殖和促转移作用[25]。因此，MIR4435-2HG可作为肝癌新的特殊预后标志物和治疗靶标。

lncRNA-miRNA-mRNA不仅通过形成复杂的调控网络结构调控靶基因及下游信号通路，lncRNA亦可直接和蛋白质相互作用而发挥作用，如，其在转录水平可通过影响特定转录因子及聚合酶活性调节mRNA的生成；也可以在转录后水平调控mRNA，包括剪接、加工、转运、翻译以及降解等过程。lncRNA在转录水平和转录后水平参与调节mRNA的表达，表明其在基因的表达调控中发挥着重要作用。

目前，lncRNA与肝癌的相关研究较多，且大多数已经过实验证实，但如何将其更好的应用于临床，作为肝癌治疗及预后的指标仍有待进一步探究。

2.3 circRNA作为ceRNA在肝癌中的作用 circRNA是一类具有共价闭环结构的非编码RNA,通常以套索循环或反向间隔的方式由mRNA的外显子衍生而来[26]。circRNA主要分布在细胞质中，一些circRNA含有miRNA响应元件，提示circRNA可能作为ceRNA竞争miRNA结合位点，影响miRNA的活性，从而发挥“海绵” 作用，进而参与一系列生物学过程[27]。越来越多的研究[28-29]表明，circRNA可通过竞争性结合miRNA调控靶基因和下游信号通路，参与到多种肿瘤的发生和进展。

Kong等[30]在肝癌发展机制的研究中发现，circRNA CircUGGT2含有miR-526b-5p的结合位点，可阻断miR-526b-5p与RAB1A的3′UTR结合。RAB1A是Rab癌基因家族成员之一，是多种恶性肿瘤的致癌基因，其编码产物介导内质网和高尔基体转运系统之间的动态膜运输。这一转运系统涉及各种重要的信号转导过程，包括调控细胞生长、脂质代谢和自噬。此外，有报道[31]称RAB1A在肝癌中可以促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭。miR-526b-5p的过表达下调了肝癌细胞中RAB1A的水平，从而抑制肝癌的发展。当过表达circUGGT2时，则可以拮抗miR-526b-5p的这种抗肿瘤效应。该研究表明，circUGGT2在肝癌中起着致癌作用。通过调节miR-526b-5p/RAB1A轴，circUGGT2的下调可以抑制肝癌的发展，这表明circUGGT2可能是治疗肝癌的潜在靶标。

DAB2IP蛋白是一种GTP酶激活蛋白，可介导多种肿瘤相关信号通路, 如RAS-RAF-MAPK通路、PI3K/AKT通路等，在多种类型的癌症中均显著下调，其在肝癌中表达降低多预示着预后不良。DAB2IP在体外和体内均具有抑制肿瘤细胞生长的能力，是一种相当理想的抗癌治疗靶点。Liu等[32]关于人肝癌发病机理的研究提示，circRNA-5692与靶向DAB2IP mRNA的miR-328-5p相互作用，即circRNA-5692充当ceRNA来抑制致癌的miR-328-5p发挥作用，以增强肿瘤抑制物DAB2IP的表达，从而抑制肝癌细胞的恶性行为，同时抑制上皮间充质转化过程。Hippo信号通路在正常细胞中发挥抑癌作用，YAPS是Hippo信号通路的主要效应因子，在多种癌症的发生发展中有重要作用。Zhang等[33]发现circ_104075作为ceRNA通过吸收miR-582-3p上调YAP表达，从而刺激肝癌的发生发展，进一步证明了circRNA作为ceRNA在肝癌细胞中的关键作用。

这些研究均表明circRNA可作为ceRNA在肝癌的发生发展中起重要作用。而与其他非编码RNA相比，circRNA由于其共价闭环结构的存在，不易被RNA外切酶所降解，并能稳定存在于体液中。因此，circRNA是一种应用前景良好的肝癌诊断标志物。

2.4 假基因作为ceRNA在肝癌中的作用 假基因是古代蛋白质编码基因的残体，在进化过程中失去了编码能力。人类基因组中有超过14 000个假基因，假基因虽然广泛存在，但曾被认为是基因组的垃圾或遗迹，直到最近几年才引起生物学家的足够重视。随着高通量实验技术的广泛应用，越来越多的证据表明一些假基因具有特定的功能，包括调控亲代基因的表达和参与调控多种生物学过程[34]。

有充分的研究证实假基因可以在人体内发挥ceRNA效应。RACGAP1基因在多种癌细胞中呈现高表达,与肿瘤的预后不良和侵袭性高度相关。Wang等[35]揭示了假基因RACGAP1P 3′UTR中有一个miR-15a-5p结合位点，其可作为靶基因RACGAP1的ceRNA竞争结合miR-15a-5p，以拮抗miR-15a-5p对内源性靶蛋白RACGAP1的抑制作用，同时RhoA/ERK通路被激活，从而促进肝癌的恶性表型。这些发现为RACGAP1P在肝癌肿瘤发生中的关键作用提供了强有力的证据。丝氨酸蛋白激酶BUB1可通过形成复合物的形式参与到其他重要周期蛋白的调控，进而影响整个细胞周期的进程，其在多种恶性肿瘤中高表达，并与预后不良高度相关[36]。有研究人员[37]发现假基因DUXAP8在肿瘤样本中表达上调，并在肝癌中作为一种致癌基因。Zhang等[38]进一步实验证实敲除DUXAP8可显著抑制肝癌细胞增殖和细胞周期，诱导肝癌细胞凋亡。该研究表明在肝癌中，假基因DUXAP8作为miR-490-5p的海绵，促进BUB1的表达，调控肝癌的增殖。另有研究[39]显示INTS6通过作用于Wnt/β-catenin通路，在肝癌中可作为抑癌基因参与肿瘤的生物进程, 其可参与调控肝癌细胞的侵袭、增殖能力等。发现假基因INTS6P1在肝癌中被显著下调，提示INTS6P1可作为一种新型的肝癌生物标志物。进一步研究发现它通过与miR-17-5p竞争性结合其同源基因INTS6发挥重要的肿瘤抑制作用。miR-17-5p靶向INTS6，拮抗其肿瘤抑制作用并提高了肝癌细胞的致癌活性。INTS6P1的上调充当miR-17-5p的海绵分子，并诱导肝癌组织的生长停滞和肝癌细胞的死亡。

目前关于lncRNA-miRNA-mRNA和circRNA-miRNA-mRNA网络在肝癌中机制的研究很多。然而，较少有研究或报道肝癌中的假基因-miRNA-mRNA网络，因此假基因在肝癌发病机制，特别是肝癌早期复发中的作用仍不完全清楚。

3 小结与展望

本文回顾了一种可在肝癌发病机理中发挥重要作用的机制——ceRNA调控网络。在正常条件下，由于ceRNA调控网络的微妙平衡，可以维持复杂的细胞系统。一旦打破这种平衡，各种非编码和编码RNA之间就会出现竞争，将细胞转变为致癌状态。但也正是这种ceRNA调控机制为癌症的治疗提供了更多选择：通过表达所需的ceRNA或通过病毒载体敲除相应miRNA来恢复细胞平衡的ceRNA治疗拥有广阔前景。

由于参与ceRNA网络的lncRNA、circRNA、miRNA和miRNA的靶向mRNA多有异常表达，且相比传统的肝癌诊断生物标志物更具特异性，因此它们可以成为肝癌良好的潜在治疗靶点和诊断标志物。目前，经典的生物标志物(如甲胎蛋白)仍被临床上用作检测早期肝癌的金标准，所以寻找可以更好应用于临床的ceRNA肝癌诊断标志物很有必要且前景广阔。

此外，当前研究多集中于寻找可以作为诊断肝癌的生物标志物或治疗靶点的ceRNA，对于其参与肝癌细胞化疗耐药性的探索较少。例如，索拉非尼作为一种新型多靶点抗肿瘤药物，是目前治疗晚期肝癌的有效药物。但是，在肝癌治疗期间经常可以观察到肝癌细胞的索拉非尼耐药现象。有文献[40]报道在耐索拉非尼的肝癌细胞中发现了circRNA的异常表达，这些异常表达的circRNA是否通过ceRNA调控机制参与到肝癌细胞的索拉非尼耐药呢？ceRNA调控网络参与肝癌细胞放化疗耐受机制的潜在的分子机制是怎样的？这仍待进一步探究。

总之，目前ceRNA研究处于热门阶段，尽管ceRNA调控网络已在生物信息学方面进行了广泛的探究，但相应“湿实验”仍相对较少。对于肝癌中ceRNA网络调控的理解仍然有限，许多与肝癌相关的miRNA和非编码RNA尚未被识别。在今后研究中，一方面需要发现肝癌中更多的ceRNA调控网络，另一方面需要探索ceRNA调控机制在临床实践中的应用，为肝癌诊疗提供新的途径。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明：陈晓昊负责拟定写作思路，检索文献，撰写论文；邓益斌负责指导、修改论文并最终定稿。