伊马替尼通过抑制小胶质细胞活化改善蛛网膜下腔出血后早期脑损伤

韩雨薇，王晨辰，李晓明

0 引言

蛛网膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是一种致死率高、预后差、严重威胁生命的脑血管疾病[1]。SAH占所有卒中亚型的5%，其中动脉瘤破裂是引起蛛网膜下腔出血患者死亡的主要原因。尽管有早期影像诊断和手术治疗，但SAH的高死亡率和不良预后仍导致很大的社会经济负担[2]。神经炎症被认为是SAH后早期脑损伤(Early brain injury,EBI)的主要病理过程之一[3]。脑内的小胶质细胞/星形胶质细胞活化和外周免疫细胞浸润释放出大量的促炎细胞因子，从而放大炎症反应，进一步加重神经功能缺损。因此，针对神经炎症的治疗策略对于减轻蛛网膜下腔出血后的早期脑损伤和改善神经学预后将是切实可行的。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ(Peroxisome proliferator-activated receptor,PPARγ)是一种配体激活型核受体，PPARγ在调节炎症和免疫反应以及保护细胞凋亡和氧化应激方面具有重要作用[4]。PPARγ激活剂伊马替尼是一种被批准用于治疗慢性粒细胞白血病和其他恶性肿瘤的抗癌药物[5]。有研究表明，伊马替尼能够抑制Tenascin-C表达，改善大鼠蛛网膜下腔出血后的脑血管痉挛[6]。然而，伊马替尼在SAH中的炎症调节作用及其可能的机制仍未见报道。因此，本研究将讨论伊马替尼通过调节炎症反应保护SAH后早期脑损伤的作用。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与动物 伊马替尼(诺华公司,规格：100 mg，批号：152459-95-5)，二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)，PPARγ(美国Cell signaling technology公司)，iba-1 (美国Abcam公司)，IL-6 (美国Cell signaling technology公司)，TNF-α、IL-1β和β-actin (美国Santa Cruz Biotechnology公司)，BCA蛋白定量试剂盒、蛋白酶磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL化学发光试剂盒及5×loading buffer (碧云天生物技术有限公司)，IL-1β、IL-6、和TNF-α ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所)。

SD雄性大鼠购自北部战区总医院实验动物中心(沈阳)，实验动物生产许可证号SCXK(辽)2014-0002。所有大鼠在固定灌注和手术前均处于麻醉状态。

1.2 分组及给药 大鼠随机分为3组，每组32只，分别为：假手术组、模型组、伊马替尼组。伊马替尼在DMSO中溶解，注射前稀释于生理盐水中(DMSO终浓度为10%)。SAH模型制作30 min后，腹腔注射伊马替尼50 mg/kg，给药剂量参考之前研究[7]。

1.3 SAH大鼠模型建立 用改进的血管内穿孔方法诱导大鼠实验性SAH模型，如前所述[8]。大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(35 mg/kg)麻醉，仰卧位手术，颈部正中切开切口。在暴露左侧颈动脉后，将3 cm长的锐化单丝尼龙线(4-0)插入颈外动脉，经颈内动脉向大脑前动脉和大脑中动脉分叉处推进，在此分叉处，再进一步轻微推进(3 mm)，造成出血。假手术组动物接受同样的手术，但没有动脉穿孔。手术后，大鼠被单独安置在加热板上。

1.4 SAH严重程度评分 每组8只大鼠，SAH造模24 h后取脑标本，根据Sugawa评分标准[9]，将基底池分为6个节段，根据蛛网膜下腔出血量,将每个节段划分为0～3级。0级：无蛛网膜下腔出血；1级：蛛网膜下腔微量出血；2级：中度凝块；3级：血块和可识别的动脉。将6个节段的分数相加(总分0～18)，出血量越大分级越高。

1.5 神经功能评分 SAH造模24 h后，根据Sugawa评分标准[9]，评估由6个测试组成：自发活动(0分：不活动；1分：仅可移动；2分：能触壁，不到3面；3分：自由运动，触到笼子至少3面)、四肢运动的对称性(0分：肢体不能运动；1分：肢体极度无力，仅有轻微活动；2分：肢体无力，运动迟缓；3分：四肢对称，与正常无差异)、前爪伸展(0分：无动作；1分：仅有轻度伸展；2分：较正常差；3分：同SAH前)、攀登(1分：不能攀爬，滚下；2分：攀爬困难；3分：爬行容易，抓笼有力)、身体本体感觉(1分：无反应；2分：仅有轻微反应；3分：迅速转头，对侧对称)、对胡须刺激的反应(1分：无反应；2分：轻微反应；3分：双侧对称反应)。最高分为18分，最低分为3分，分数越高，功能越强。

1.6 方法

1.6.1 脑水肿含量测定 每组8只大鼠，造模24 h后处死取大脑，分为左右大脑半球和小脑，称湿重。然后将脑标本在110 ℃的烤箱中烘干72 h，并再次称重(干重)。脑含水量按以下公式计算：脑含水量(%) =(湿重-干重)/湿重×100%。

1.6.2 Evans blue渗透率测定 每组8只，将Evans blue染料(2%，5 ml/kg)注入左股静脉循环1 h，麻醉后用生理盐水心内灌注处死大鼠并取脑，分为左右大脑半球和小脑，称重后浸泡在甲酰胺中(10 ml/g)，60 ℃孵育，用分光光度计测量渗出物在620 nm处的吸光度。

1.6.3 Western blot分析 Western blot分析和ELISA检测共用8只/组。鼠脑蛋白样品在RIPA缓冲液中提取，在4 ℃转速12 000 r/min离心15 min。收集上清液，BCA试剂盒测定蛋白浓度。等量蛋白质样品经SDS-PAGE凝胶分离后转移到硝酸纤维素膜上。然后，用下列一抗在4 ℃下封闭膜并孵育过夜：PPARγ (1∶400)、IL-6 (1∶400)、TNF-α (1∶400)、iba-1 (1∶500)，β-actin (1∶800)。将对应的二抗(1∶2 000)在室温下孵育2 h，用ECL试剂显示特异性条带。用ImageJ软件分析免疫印迹带的相对密度。

1.6.4 ELISA检测 每组8只，根据南京建成生物工程研究所生产的试剂盒说明书检测蛋白样品中IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度。

1.6.5 免疫荧光染色 免疫荧光染色和TUNEL染色共用8只/组。造模24 h后快速取出大鼠脑组织，用PBS洗涤2次，固定在4%甲醛溶液中24 h，分别用iba1(1∶50) 4 ℃孵育过夜。荧光二抗1∶100稀释，室温孵育1 h。荧光显微镜(Nikon)拍照。

1.6.6 TUNEL染色 用TUNEL染色试剂盒检测凋亡细胞，方法参考说明书。

2 结果

2.1 伊马替尼对SAH评分、神经功能评分和血脑屏障的影响 与假手术组相比，SAH模型组SAH评分增加(图1A)，神经功能评分降低(图1B)，脑水肿含量增加(图1C)，Evans blue渗出量增加(图1D)。然而，伊马替尼给药后能够降低SAH评分，提高神经功能评分，减少脑水肿含量，降低Evans blue渗出量。提示伊马替尼能够显著减少SAH后脑出血量，提高神经功能，减轻血脑屏障破坏程度。

图1 伊马替尼对SAH分级、神经功能评分、脑水肿和渗出的影响注：##与假手术组相比，P<0.01；**与模型组相比，P<0.01

2.2 伊马替尼对蛛网膜下腔出血后炎症反应的影响 与假手术组相比，SAH模型组PPARγ表达量无显著变化，而伊马替尼能够显著增加PPARγ的表达(图2A)。与假手术组相比，SAH模型组IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表达量增加，伊马替尼能够抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(图2B-2E)。ELISA结果同样表明，伊马替尼能够显著减少IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平(图2F-2H)。

图2 伊马替尼对PPARγ、IL-6、IL-1β和TNF-α表达的影响注：Western blot蛋白条带(A)，PPAR蛋白表达量统计图(B)，IL-1β 蛋白表达量统计图(C)，IL-6 蛋白表达量统计图(D)，TNF-α蛋白表达量统计图(E)，IL-1β蛋白水平(F)，IL-6蛋白水平(G)，TNF-α蛋白水平(H)。##与假手术组相比，P<0.01；**与模型组相比，P<0.01

2.3 伊马替尼对蛛网膜下腔出血后小胶质细胞活化的影响 Western blot结果显示，与假手术组相比，SAH模型组小胶质细胞(iba-1)表达量增加，伊马替尼降低iba-1的蛋白表达量。免疫荧光结果显示，SAH模型组小胶质细胞激活，而伊马替尼能够显著抑制小胶质细胞的活化(图3)。

图3 伊马替尼对小胶质细胞活化的影响(400×)注：红色为iba-1，小胶质细胞标记物；蓝色为DAPI，细胞核标记物。##与假手术组相比，P<0.01；**与模型组相比，P<0.01

2.4 伊马替尼对蛛网膜下腔出血后神经元细胞凋亡的影响 如图4所示，荧光染色结果显示，与假手术组相比，蛛网膜下腔出血组TUNEL阳性细胞数显著增多，而伊马替尼能够减少TUNEL阳性细胞数，有效抑制神经元细胞凋亡。

图4 伊马替尼对神经元细胞凋亡的影响(400×)注：绿色为TUNEL，凋亡标记物；红色为NeuN，神经元标记物；蓝色为DAPI，细胞核标记物。##与假手术组相比，P<0.01；**与模型组相比，P<0.01

3 讨论

伊马替尼是一种被批准用于治疗慢性粒细胞白血病和其他恶性肿瘤的抗癌药物[5]。伊马替尼抑制多种酪氨酸激酶，包括血小板衍生生长因子受体(Platelet-derived growth factor receptors α,PDGFR-α)，并且可以减轻缺血性卒中和开始纤溶酶原激活剂治疗后的脑水肿[10]。此外，伊马替尼抑制PDGFR-α，在脑出血小鼠模型中保存了血脑屏障的完整性[8]。

在本研究中，伊马替尼对大鼠蛛网膜下腔出血后早期脑损伤具有保护作用，抑制小胶质细胞激活，减轻炎症反应抑制神经元细胞凋亡，其潜在的机制可能与PPAR-γ激活相关。

炎症在蛛网膜下腔出血后早期脑损伤中起重要作用[11]。小胶质细胞是神经炎症的主要来源，因此，我们检测了伊马替尼对小胶质细胞激活的影响。结果显示，伊马替尼抑制蛛网膜下腔出血后小胶质细胞的激活，减少早期脑损伤激活的小胶质细胞的数量。有研究表明，在蛛网膜下腔出血早期和晚期中，发现小胶质依赖的凋亡[12]。因此，蛛网膜下腔出血中的抗凋亡作用可能是通过调节小胶质细胞的激活来实现的。然而，小胶质细胞激活影响细胞凋亡的确切机制还有待进一步研究。具有吞噬功能的神经胶质细胞，一般称为小胶质细胞，是脑内一种特有的免疫细胞[13]。SAH后激活的小胶质细胞分泌促炎细胞因子IL-6、IL-1β、TNF-α，诱发周围细胞凋亡[14]。

本研究结果表明，伊马替尼可改善SAH后的神经行为，减轻脑水肿，抑制SAH后小胶质细胞的活化。伊马替尼能显著增加PPARγ的表达，降低促炎细胞因子的表达。表明伊马替尼可能通过PPARγ抑制小胶质细胞活化途径减轻蛛网膜下腔出血后的神经炎症,从而对蛛网膜下腔出血后的EBI有保护作用。