髓母细胞瘤分子分型及危险分层的研究进展

李伟清 综述 董子龙 陈 乾 审校

髓母细胞瘤(medulloblastoma,MB)是儿童时期最常见的中枢神经系统(central nervous system,CNS)恶性肿瘤，约占所有儿童CNS肿瘤的15%～20%[1]。WHO中枢神经系统肿瘤分级将其归类为Ⅳ级，组织学上恶性程度高，极易通过脑脊液传播，主要分为经典型(classic)、促结缔组织增生/结节型(desmoplastic/nodular，DN)、广泛结节型medulloblastoma with extensive nodularity，MBEN)和大细胞/间变型(large cell/anaplastic，LC/A)四种病理亚型[2]。MB儿童患病年龄呈现3～4岁和8～10岁双峰特点[2,3]。目前基于病理分型的手术联合放化疗的综合治疗方法可在一定程度上提高患者远期生存率，5年生存率标危组已提高到85%，高危组也提高到70%[4]。然而，MB预后与治疗并发症密切相关，如神经认知障碍、内分泌缺陷和继发性肿瘤等[5]。另外，婴幼儿和有转移、复发的患者长期生存率仍然很低[6,7]。近年来，整合基因组学研究表明，MB不是一个单一形态的实体肿瘤，在分子水平上，至少可以分出四种在生物学表现、临床特征及预后方面均具有明显差异的分子亚型[8]。国内外学者对MB进行了分子分型及危险分层，进一步改善了患者的预后。2016年WHO更新了中枢神经系统肿瘤的分类，新增MB四种分子分型，分别为WNT活化型、SHH活化型、Group 3型、Group 4型，SHH活化型再分为TP53突变型和野生型[2]。目前推荐采用DNA甲基化图谱取代基因表达图谱作为MB分子分型诊断的金标准[9-11]。伴随研究方法的不断更新，肿瘤内的异质性进一步被识别，可将MB根据原来的研究基础进一步细分为7～12个亚型[12,13]。

一、髓母细胞瘤分子分型特点

(一)WNT型MB

WNT型MB起源于胚胎下菱唇祖细胞，根据在该亚群的发病机制中起重要作用的WNT信号通路命名[14,15]。此类发病人数占比最少，约占所有MB的11%，青少年多见，极少见于婴幼儿，男女性别比例约1∶1。在组织学水平上，几乎均为经典型，极少部分为LC/A型[16]。该型是所有亚型中预后最好的，很少发生转移，16岁以下的MB患者5年生存率超过95%，可能与该型缺乏完整的血脑屏障，允许高浓度的化疗药物在肿瘤内积累有关[17]。CTNNB1基因的第3号外显子活化突变是WNT亚型最显著的标志，而CTNNB1基因编码的β-catenin蛋白是WNT信号通路重要的效应因子，β-catenin在细胞核内不断聚集，通过与TCF-LEF家族转录因子的共同作用，进一步激活下游靶基因，从而引起该型肿瘤的发生[7,18]。缺乏体细胞CTNNB1突变的WNT型MB常含有肿瘤抑制基因APC的突变[19]。肿瘤抑制基因APC可通过调控腺瘤性结肠息肉病 (adenomatous polyposis coli,APC)蛋白介导β-catenin的降解[18]。这正好可以解释由于APC基因突变导致的Turcot综合征通常具有明显的遗传易感性，且常合并MB的发生[20,21]。另外，比较常见的突变还包括DDX3X(36%)、SMARCA4(也称为BRG1，19%)、CSNK2B(14%)、PIK3CA(11%)、EPHA7(8%)和TP53(14%)[9]。尽管TP53突变是SHH型MB和其他癌症的高风险标记，但对于WNT型MB患者，TP53突变在生存率上没有明显差异[7]。细胞遗传学上的显著特征是6号染色体出现单倍体，常同时伴有CTNNB1基因突变[22]。然而这两者并非存在于所有的WNT型MB中，临床上常规将两者中的任意一个阳性作为WNT型MB的判定标准，但这样会漏诊10%～15%的真正WNT型MB患者[23]。Schwalbe等[8]通过对DNA甲基化的分析研究发现，该型显著的五个基因高甲基化位点分别为P360(ASCL2)、E76(ASCL2)、P609(ASCL2)、P49(MT1A)、E13(MT1A)和低甲基化位点分别为P344(HDAC7A)、P493(RAB32)、E331(DDR2)、E273(HFE)、P414(HDAC1)。有研究者用SNF(similarity network fusion)的方法进一步鉴别出WNTa 和WNTb两个子亚型：WNTa主要分布在儿童群体，有普遍存在的6号染色体单倍体；WNTb主要分布在成年人群体，常伴有6号染色体的二倍体[22]。

(二)SHH型MB

SHH型MB起源于小脑的颗粒神经元前体细胞(granule neuron precursors,GNPs)，常位于一侧小脑半球，同样根据在亚群的发病机制中起重要作用的SHH信号通路命名[14,15,24]。SHH信号通路在诱导GNPs增殖和迁移小脑发育的过程中起重要作用[7]。该型约占所有MB的28%，好发生于婴幼儿和成人，男女性别比近1∶1。组织学上可表现为四种病理的任何一种，但几乎所有MBEN都属于SHH 型，预后中等，5年生存率在60%～80%[16]。大部分SHH型MB的SHH信号通路相关基因均存在生殖系或体细胞突变和拷贝数改变，包括PTCH1(43%)和SUFU(10%)的失活突变或缺失、SMO的活化突变(9%)、GLI1或GLI2(9%)和MYCN(7%)的扩增[9]。PTCH1的失活突变或缺失直接导致受跨膜蛋白PTCH1抑制的G蛋白偶联受体SMO发生转位至纤毛膜，活化下游GLI蛋白家族从其自然抑制因子SUFU释放出来，然后进入细胞核，转录激活参与小脑GNP增殖的基因，最终导致肿瘤形成[1,25,26]。TP53突变发生在21%的SHH型MB中，预后很差，是导致该型MB最重要的危险因素[27]。另外TERT(telomerase reverse transcriptase)启动子突变约在83%的SHH型MB中发现，年龄分布差异明显，98%的成人SHH型MB携带体细胞TERT启动子突变，而婴儿和儿童SHH型MB分别占13%、21%[28,29]。常见于神经胶质瘤的IDH1基因突变也在该亚型中被发现，这些突变导致DNA高甲基化表型与在其他IDH1/2突变型癌症中发现的表型类似[23]。细胞遗传学标志性特征包括染色体9q和10q的缺失，这直接导致关键的肿瘤抑制基因丢失，如PTCH1(位于9q22)和SUFU(位于10q24)，它们分别编码SHH信号的负调节因子，以及其他潜在的调控因子[30]。显著的五个基因高甲基化位点分别为P1008(MSH2)、P270(CCKAR)、E79(CCKAR)、E90(DSC2)、P93(IL16)，低甲基化位点分别为E9(VAV1)、P317(VAV1)、E273(HFE)、P833(TGFB1)、E333(MET)[10]。Schwalbe等[13]研究发现可依据年龄将SHH型再分为MBSHH-Infant(<4.3 岁)和MBSHH-Child(≥4.3 岁)：MBSHH-Infant病理分型多为DN型，富含SUFU突变，预后较好，5年总生存率约为62%；MBSHH-Child病理多为LC/A型，主要表现为TP53、TERT突变和MYCN、GLI2的扩增，DNA甲基化水平高，染色体9q缺失和9p获得，5年总生存率约为58%。Robinson等[31]在研究≤5岁儿童SHH亚群MB中，发现了两种不同的甲基化亚型，并命名为iSHH-Ⅰ和iSHH-Ⅱ。iSHH-Ⅰ中位年龄为2.0岁，男女比1.3∶1，富含SUFU突变、染色体2获得，预后较差，5年无进展生存率为27.8%；iSHH-Ⅱ中位年龄亦为2.0岁，男女比例1∶1.3，富含SMO活化突变、染色体9q缺失，预后较好，5年无进展生存率为75.4%。Cavalli[12]等综合聚类分析鉴别出SHHα、SHHβ、SHHγ和SHHδ四个子亚型：SHHα预后最差，TP53突变，富含MYCN、GLI2、YAP1扩增并染色体9q、10q和17p缺失；SHHβ多见于婴幼儿，多伴有转移，预后较差；SHHγ病理多为MBEN，预后较好；SHHδ主要由成年人组成，富含TERT启动子突变[12]。

(三)Group3型MB

Group3型MB真正起源尚不清楚，常位于脑干附近的第四脑室[32]。有研究显示Trp53缺失的小脑祖细胞可以转化为与之类似的肿瘤[33]。该亚型MB约占所有MB的27%，好发于10岁以下的儿童，成人罕见，男女性别比近2∶1。病理类型以经典型为主，但大部分LC/A型也属于此型，易发生转移，临床预后最差[16]。MYC基因高水平扩增是该型最显著的特征，常同时伴有非编码RNAPVT1共扩增，后者可以协助MYC蛋白高水平稳定表达[9,34]。也有研究发现，存在PVT1的1号和3号外显子与MYC的2号和3号外显子会发生融合转录[35]。其它突变率较高的基因还包括SMARCA(9%)、KBTBD4(6%)、CTDNEP1(5%)和KMT2D(5%);此外还有MYCN(5%)和OTX2(3%)的扩增，OTX2作为一种转录因子，在控制不同祖细胞分化的过程中起着重要的作用[7,9,23]。已有研究识别出原癌基因GFI1和GFI1B在大约1/3的Group3型MB会出现互斥的活化，导致体细胞基因重排[36]。循环性基因事件通路分析揭示Notch和TGF-β信号通路相关基因在此型中出现显著的过度表达[23]。细胞遗传学方面主要表现为染色体1q、7和17q的扩增，以及10q、11q、16q和17p的缺失。此外还存在等臂染色体17q(isochromsome17q，i17q)，可作为Group 3亚型MB不良预后的重要标志[37,38]。另外，一些微小RNA(如MiR-182、MiR-135b等)在Group 3型MB中可呈过表达[39]。NPR3蛋白免疫组化染色阳性能否作为Group 3的特征性标志物有待进一步研究确认[1,8]。显著的五个基因高甲基化位点分别为P969(WRN)、E34(FES)、E273(HFE)、P223(FES)、P93(IL1RN)，低甲基化位点分别为P668(BLK)、E102(ZNFN1A1)、P605(THBS2)、E268(PLA2G2A)、P226(CHI3L2)[10]。Schwalbe等[13]将Group3型分为MBGrp3-HR和MBGrp3-LR：MBGrp3-HR病理多为LCA型，富含MYC扩增、GFI1突变、i17q，还有大量甲基化CpG位点，5年总生存率为37%；MBGrp3-LR病理多为经典型，婴幼儿居多，细胞遗传学表现为多个染色体的缺失，预后相对较好，5年总生存率为69%[13]。Cavalli等[12]综合聚类分析结果鉴别出Group3α、Group3β and Group3γ三个子亚型：Group3α分布为大部分婴幼儿，多伴转移，伴8q缺失，预后相对较好；Group3β转移发生较少，GFI1和GFI1B癌基因的活化频率更高，OTX2扩增；Group3γ预后较差，伴8q获得，富含i17q，MYC(8q24)拷贝数增加。

(四)Group4型MB

Group4型MB疑似起源于胚胎上菱唇前体细胞，与Group3型相似，也好发于脑干附近的第四脑室[31,40]。该型发病人数约占所有MB的34%，发病年龄高峰在5～13岁，男女性别比近2∶1，组织学以经典型最常见[16]。预后中等和SHH型类似，介于WNT型和Group3型之间。Group4亚型最显著的驱动事件为增强子劫持介导的PRDM6活化过表达[23]。也常见SNCAIP基因(位于5q23.2)的串联复制[35]。PRDM6位于SNCAIP下游近600 kb的位置，且PRDM6在有SNCAIP相关的结构变异的Group 4型中MB表达显著提高[23]。其他的基因突变还包括KDM6A(9%)、ZMYM3(6%)、KMT2C(6%)、KBTBD4(6%)的突变，以及MYCN(6%)和OTX2的扩增(6%)、CDK6(6%)和GFI1和(或)GFI1B过表达(5%～10%)[23]。有研究显示，卵泡素相关蛋白5(follistatin-related protein 5,FSTL5)是Group 4亚型MB预后不良生物学标记物[41]。大量染色体畸变在该型中被发现，最常见的结构改变为i17q，占比约80%[7]。然而Group4型MB，i17q在判断预后方面不如在Group 3型中明显[38]。另外还有染色体7(40%～50%)、染色体17q(>80%)的扩增，染色体8(40%～50%)、染色体11(>30%)、染色体17p (>75%)的缺失[34]。显著的五个基因高甲基化位点分别为P993(WNT10B)、E189(TRIM29)、P414(HDAC1)、E136(MMP10)、E333(MET)，低甲基化位点分别为P307(PIK3R1)、E79(CCKAR)、Seq48S1(HIC1)、P270(CCKAR)、P581(RAN)[10]。Schwalbe等[13]将Group4型也分为MBGrp4-HR和MBGrp4-LR：MBGrp4-HR，病理多为经典型，多有PRDM6的扩增；MBGrp4-LR病理多为经典型，MYCN扩增明显，伴染色体7、 17q的扩增和染色体8、11的缺失，5年总生存率约为80%。Cavalli等[12]综合聚类分析鉴别出Group4α、Group4β和Group4γ三个子亚型：Group4α富含MYCN的扩增，染色体8p的缺失和7q的扩增；Group4βSNCAIP扩增明显，同时伴有i17q的广泛存在；Group3γ富含CDK6的扩增增加[12]。

二、髓母细胞瘤危险分层

目前国内根据年龄、手术切除程度、有无转移、病理类型将MB进行分组。对于年龄>3岁的儿童MB，标危的判定标准为：肿瘤完全切除或近完全切除(残留病灶≤1.5 cm2)，无扩散转移；高危的判定标准为：手术次全切除(残留病灶>1.5 cm2)；伴有转移疾病(包括神经影像学播散性疾病，手术14 d后腰穿或脑室脑脊液阳性细胞学证据或颅外转移；病理组织学弥漫间变型)。对于年龄≤3岁儿童MB，标危的判定标准为：同时符合肿瘤完全切除或近完全切除(残留病灶≤1.5 cm2)、无扩散转移、病理亚型为促结缔组织增生型和广泛结节型两项标准；除标危外全部判定为高危[42]。2015年海德堡会议就结合分子分型重新定义儿童(3～17岁)MB危险分层达成共识。根据预后5年生存率划分为四个组： ①低危组(>90%)：无扩散转移的WNT型、无扩散转移和伴染色体11的缺失或染色体17的获得的Group 4型； ②标危组(75%～90%)：无扩散转移、不伴TP53突变和无MYCN扩增的SHH型，无扩散转移和MYC扩增的Group 3型，无扩散转移和不伴染色体11的缺失的Group 4型； ③高危组(50%～75%)：伴有转移的SHH型或Group 4型，MYCN扩增的SHH型； ④超高危组(<50%)：伴有转移的Group 3型，伴有TP53突变的SHH型[43]。2017年Schwalbe等[13]通过结合新的分子分型和对215例3～16岁MB患者建立生存模型分析，根据5年无进展生存率提出新的危险分层： ①低危组(>90%)：MBWNT，没有高危标志的MBSHH-Child(高危标志：伴有转移，术后残留病灶>1.5 cm2，大细胞型/间变型，MYCN扩增)，没有MYC扩增和伴染色体13缺失的MBGrp3/Grp4； ②标危组(75%～90%)：没有MYC扩增的MBGrp3-LR/Grp4-LR； ③高危组(40%～75%)：没有MYC扩增的MBGrp3-HR/Grp4-HR； ④超高危组(<40%)：有高危标志的MBSHH-Child，MYC扩增的MBGrp3。

三、小结和展望

临床上不同的MB患者在疾病进展及预后上存在明显的差异，依据目前的危险分层及据此进行的分层治疗取得了一定的研究成果，但仍存在部分患者过度治疗或治疗不足的问题。随着分子生物学研究的进展，MB分子分型不断完善，精准医学不断进步，结合分子分型、临床特点、病理分型等因素对MB进行更加精确的危险分层，指导MB患者个体化治疗，可帮助患者从中受益。