副猪嗜血杆菌研究进展

刘俊琦

（永州职业技术学院，湖南永州425000）

副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis,H.parasuis）属于巴斯德氏家族成员，是猪上呼吸道的早期入侵菌，为猪Glasser’s病的病因菌[1]。H.parasuis可寄居于健康猪只的上呼吸道，不引起明显症状，但当猪只抵抗力下降或感染其他细菌、病毒性疾病时，H.parasuis可引起猪只出现多发性浆膜炎，甚至死亡[2,3]。H.parasuis具有多种基因型和血清型，但是至今为止未证实H.parasuis分型与细菌毒力之间有明显的联系[4]。引起H.parasuis的发病机制较复杂，通常认为细菌到达肺部后大量繁殖，随后扩散至全身，引起系统性疾病。细菌在浆膜表面复制，引起炎症损伤。鉴定副猪嗜血杆菌粘附、逃避、侵入的关键因素，可为掌握副猪嗜血杆菌的致病机制奠定基础，也为日后合理设计高效疫苗提供理论依据。

1 流行病学调查

目前有已将H.parasuis分离、鉴定为15个血清型，且各血清型之间毒力差异较大。血清4型和5型在多个国家具有高流行性，例如加拿大、美国、德国[5-7]。在中国，研究者对110个分离菌株进行分离鉴定，结果证实血清5型（26.4%）和血清4型（14.5%）为最主要菌株，与国外报道相似，其次为血清13型（10.9%）和血清12型（9.1%）[8]。在越南，血清5型H.parasuis为最主要的流行菌株（26.8%），其次为血清2型（23.2%）、4型（17.9%）、10型、9型、1型、6型、7型和8型；vta1为最主要的毒力基因（62.5%），其次为vta3（42.9%）、vta2（39.3%）、HPM-1371（35.7%）、capD（30.4%）、HPM-1372（12.5%）、lsgB（8.9%）和HPM-1373（8.9%）[9]。

2 发病机制

H.parasuis的致病机制是受多种因素影响的感染过程，它需要多种机制建立感染，从而引起猪只发病。最初H.parasuis是在上呼吸道中进行感染，但随着病情加重，细菌可扩散至肺部，引起肺炎。严重者可引起全身性感染，表现出纤维素性浆膜炎和关节炎，这些症状是Glasser’s病的典型症状[10]。H.parasuis通过粘附、入侵宿主上皮细胞从而建立早期感染[11]，通过降解IgA躲避宿主天然免疫系统[12]，并且细菌可抵抗巨噬细胞的吞噬作用[13]和补体的杀菌作用[14]。细菌可诱导气管上皮细胞产生细胞凋亡，从而破坏了气管粘膜。在肺部，通过巨噬细胞的吞噬作用可消除无毒力的H.parasuis[13]。然而，强毒菌株能通过产生囊泡躲避肺泡巨噬细胞的吞噬，使得细菌能在肺部增殖[13]。H.parasuis细菌在宿主体内大量增殖，产生强烈的炎症反应，这些炎症可引起渗透性改变，释放出炎性因子IL-6和IL-8，使得猪只表现出Glasser’s病的典型症状[15]。尽管当前对于细菌是如何到达血液的机制仍不清楚，但是推测强毒株对内皮细胞的入侵力可能在全身性感染中起着关键作用[16]。当强毒株进入血液循环后，它可有效地躲避补体介导的杀菌体系，抵制血清的杀菌作用，从而引起全身性感染，导致患病猪出现多发性浆膜炎和关节炎[14]。有研究表明，H.parasuis入侵内皮细胞的能力决定了患病猪脑膜炎感染程度[17]。毒力菌株通过入侵内皮细胞，穿过血脑屏障，引起脑膜炎[16]。

TGF-β1通过调节整合素、纤连蛋白、细胞外基质蛋白的表达，在细菌侵入细胞的过程中起着重要作用。Li等人发现TGF-β1可影响H.parasuis入侵PK-15细胞，在感染H.parasuis后PK-15细胞提升了TGF-β1的表达水平；在感染前用TGF-β1处理PK-15细胞可显著降低H.parasuis的侵袭力[18]。LuxS/AI-2是一类非常重要的群体感应系统，影响细菌生长特性、生物膜形成能力、抗体生成、毒力和新陈代谢。Zhangd等人通过敲除和回补LuxS，证实LuxS参与调节抗胁迫、生物膜形成和毒力[19]。

3 毒力因子

生物膜是细菌的一个重要毒力因子。体外实验表明，与无毒菌株相比，强毒菌株能产生较多的生物膜[20]。生物膜的产生可能仅与黏膜定植有关，与全身性定植关系不大。研究者在肺部感染病例中检测出生物膜功能相似基因siaB、hrtA、fumC、gcpE、acrR[21]。Hill等人发现在热应激下，fadD、apaH、pstI、cysK基因的表达上调[22]。Fu等人鉴定了H.parasuis细胞壁6PGD[23],该基因为猪源致病性链球菌的保护性抗原。研究发现6PGD蛋白参与细菌粘附至猪肺泡上皮细胞，并且重组的6PGD蛋白能诱导产生IL-6和IL-8，小鼠试验证实该蛋白具有免疫源性和部分保护性，认为6PGD可作为潜在的基因工程疫苗候选基因[23]。H.parasuis SH0165具有4型IV菌毛基因，包括编码主要结构单元PilA和3个生物源蛋白PilB、PilC、PilD[24]。血清4型H.parasuis gx033的基因组分析表明，该菌携带pilF基因[25]。CDT属于AB2型毒素家族，通常由3个亚基（cdtA、cdtB、cdtC）组成。在109个临床分离株和15个血清型H.parasuis中菌检测出cdtB蛋白[26]。研究发现CDT缺陷菌株对血清的敏感性增加，并降低了对猪脐静脉内皮细胞和猪肾上皮细胞的粘附和入侵[27]。在具有毒力的菌株中检测出参与产生泡囊的capD基因，而在无毒菌株中未检测出该基因[28]。在高毒菌株中敲除capD基因，结果细菌的致病力明显下降且对血清的抗性降低[29]。OmpP2是H.parasuis外膜中含量最丰富的蛋白，该蛋白在细菌中具有高保守性[30]。当缺乏OmpP5时，细菌表现出生长缓慢[31]。VtaA编码具有特异性粘附区域的外膜蛋白，该基因具抗原性，攻毒试验表现出一定的保护性，并且在小鼠试验中VtaA呈现出交叉反应[32]。在H.parasuis中组3的VtaA具有高保守性，而在毒力菌株中可检测出组1和组2的VtaA，VtaA在H.parasuis的这种差异表现可被用于构建鉴定细菌毒力的PCR方法[33]。VacJ蛋白属于外膜脂蛋白，与多种病原菌的毒力相关。Zhao等人通过敲除VacJ观察到细菌形态发生改变，NPN荧光性增加，并对SDS-EDTA、渗透压、氧化应激反应的抗性降低，从而证实VacJ在H.parasuis维持细胞完整性和耐受力中起着重要作用[34]。ArcA参与调节大量参与有氧和无氧代谢的基因，Ding等人证实敲除arcA基因使得H.parasuis在厌氧条件下的生长速度减缓，并减低细菌对小鼠的致病力[35]。Huang等人通过敲除和回补ClpP，证实敲除ClpP使得H.parasuis对热应激、氧化应激、渗透压的降低[36]。cAMP受体蛋白（CRP）是一类重要的调节子，在细菌感染过程中对适应环境变化起着重要作用，Jiang等人证实CRP基因参与细菌生长、生物膜形成、耐受性、血清抗性、铁利用[37]。

4 防治措施

当前通过免疫接种商品疫苗、自价苗是预防H.parasuis感染的重要措施，当前的研究疫苗重要包括灭活苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、弱毒疫苗。尽管接种疫苗能降低细菌的致死率，但是由于不同分型菌之间缺乏交叉保护，常导致免疫失败[38-41]。目前市场上的商品疫苗均为H.parasuis灭活苗，是由强毒株传代培养产生，经甲醛37℃灭活48h后重悬，加入矿油、氢氧化铝或者蜂胶等佐剂[42]。除了单价苗，目前市场上已出现二价、三价、四价H.parasuis疫苗，这些疫苗包含了多种血清型，具有一定的交叉保护。商品化灭活苗的广泛使用，在一定程度上降低了H.parasuis在全球的爆发。灭活苗可对接种疫苗的母猪所生仔猪提供一段时间的免疫保护。在接种2次灭活疫苗后，可诱导仔猪产生180天的免疫保护，高浓度的IgG使得疫苗的免疫时间延长。此外，高浓度的母源抗体通常持续3周，有效地保护仔猪避免感染H.parasuis，提升了仔猪存活率。并且母源抗体不干扰1～3周龄仔猪的免疫。因此，母猪分娩前接种疫苗能有效地预防Glasser’s病的发生，保护哺乳期仔猪。尽管灭活苗具有众多优点，但也存在一些缺陷：灭活苗不完全包含了区域内所有流行毒株；佐剂效果的不稳定性使得疫苗很难维持稳定的保护效果；灭活苗只能提供短时间的保护效果[42]。弱毒苗能提高免疫效果，但是由于缺乏H.parasuis主要毒力因子的研究，使得弱毒苗发展受阻[43]。当前H.parasuis疫苗的一个研究热点为通过基因敲除技术，敲除细菌中重要的毒力因子，从而构建一些活的减毒突变株，包括capD突变株、rfaE突变株、cheY突变株、hfq突变株、wza突变株、lgtF突变株[29,44,45]。近年来，大量免疫组学分析表明一些毒力因子和免疫蛋白可在不同菌株之间产生免疫保护作用，这表明研发高效的基因工程疫苗乃H.parasuis防治的大势所趋[46-49]。

在当前缺乏具有交叉保护的商品疫苗的养殖背景下，药物治疗仍是治疗本病的主要措施。研究者通过构建H.parasuisMIC值的肉汤微量稀释检测方法，对H.parasuis在德国的耐药情况进行评估，对头孢噻肟具有敏感性而对链霉素具有耐药性[50]。在丹麦，研究者发现所有分离的H.parasuis对氨苄西林、头孢噻呋、环丙沙星、红霉素、氟霉素、青霉素、大白菜霉素、四环素、噻穆林或替米考星均敏感；有2株H.parasuis对甲氧苄氨嘧啶和新若明具有耐药性；有6株H.parasuis对环丙沙星的敏感性降低；有10株H.parasuis对TMP和磺胺甲恶唑的敏感性降低[51]。在中国，Zhou等人报道所分离的110株H.parasuis对头孢噻肟、头孢噻呋、阿奇霉素、氯霉素、氟苯尼考和替米星敏感[51]。恩若沙星具有氟喹诺酮活性，可用于治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染[52]。恩若沙星通过抑制细菌的DNA旋转酶（一种II型拓扑异构酶），阻碍了细菌中DNA超螺旋的形成和复制，从而引起细菌的死亡[53]。有研究发现H.parasui对恩若星沙比较敏感，使用恩若沙星治疗可减轻猪上呼吸道中H.parasuis感染症状[3]。